李君蕊，肖 颖，付盈菊，张雅丽，卢玉娟，亢瑞娜，赵宝春
(河北医科大学附属唐山工人医院：1.感染科；2.肿瘤内科；3.急诊内科；4检验科 063000)
IL-1RN-2018多态性及IL-1Ra/IL-1β比值与非小细胞肺癌的关系
李君蕊1，肖 颖2，付盈菊3，张雅丽1，卢玉娟4，亢瑞娜1，赵宝春1
(河北医科大学附属唐山工人医院：1.感染科；2.肿瘤内科；3.急诊内科；4检验科 063000)
目的 探讨白细胞介素受体拮抗剂(IL-1Ra)编码基因2018(IL-1RN-2018)多态性及血清IL-1Ra/IL-1β比值与非小细胞肺癌(NSCLC)的相关性。方法 2012年1月至2014年1月选取85例NSCLC患者作为NSCLC组，80例健康体检者作为对照组，采用荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线(HRM)技术检测IL-1RN-2018 T/C基因SNP，随机选取10%进行基因测序验证，应用ELISA法测定两组血清中IL-1Ra及IL-1β水平。结果 (1)NSCLC组患者IL-1RN-2018基因的TC型、TC+CC型的NSCLC发病风险分别为TT型的2.646倍和2.315倍，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)鳞癌患者与腺癌患者比较，IL-1RN-2018 T/C 基因型分布及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。(3)NSCLC组患者的血清中IL-1Ra、IL-1β水平显着高于对照组，IL-1Ra/IL-1β低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。(4)NSCLC组中各基因型患者的血清IL-1Ra水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-1RN-2018的C等位基因携带者的NSCLC患病风险增加；IL-1Ra/IL-1β的降低可能预示NSCLC患病风险。
白细胞介素1受体拮抗剂；白细胞介素1β；基因多态性；癌，非小细胞肺
非小细胞肺癌(NSCLC)的发病率和病死率极高,其病因和发病机制尚未完全阐明，有流行病学调查研究显示吸烟、日常饮食及生活环境等因素在肺癌的发生、发展中起重要的作用[1],近年研究发现基因在其中扮演了重要的角色[2-3]。白细胞介素-1(IL-1)与NSCLC发生、发展有密切的关系，白细胞介素受体拮抗剂(IL-1Ra)可通过竞争性与IL-1受体结合从而参与肿瘤免疫反应和调节过程[4]。本研究将通过检测IL-1Ra编码基因2018(IL-1RN-2018)rs419598位点的单核苷酸多态性(SPN)及血清IL-1Ra水平、IL-1β水平、IL-1Ra/IL-1β，探讨其与NSCLC的关系，为NSCLC尽早诊断及治疗提供依据。
1 资料及方法
1.1 一般资料 2012年1月至2014年1月选取85例NSCLC患者为研究对象(NSCLC组)，纳入标准：(1)患者Karnofsky评分(KPS)≥60分；(2)患者均经病理组织学、影像学确诊；(3)患者TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期；(4)患者在知情同意下参与研究。其中男48例，女37例，年龄28～78岁，平均(52.63±4.12)岁，病程3个月至2年，平均病程(8.12±2.12)个月。TNM分期为Ⅰ期35例，Ⅱ期30例,Ⅲ期20例。鳞癌52例，腺癌23例，其他类型10例。其中接受手术治疗者60例，余下的患者行放射化学治疗。排除急慢性感染，肝、肾、心脑血管及内分泌疾病者。另选取同期在本院行身体检查的80例健康体检者为对照组，其中男 44例，女36例，年龄35～80岁，平均(51.98±4.24)岁，患者影像学、血液肿瘤标记物及实验室生化指标诊断确诊为健康人群。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 空腹抽取各组静脉血3 mL，经离心处理后留取上清液，采用乙二胺四乙酸二钾抗凝全血标本，采用日本TOYOBO磁珠法DNA提取试剂盒提取DNA，操作过程严格按照试剂盒说明进行，将DNA标本置入-80 ℃冰箱中保存。
1.2.2 引物及探针的设计与合成 IL-1RN-2018 rs419598 基因序列PCR扩增引物及探针由上海生工生物有限公司合成，由北京赛百盛生物技术公司提供。上游引物5′-GGG ATG TTA ACC AGA AG ACCT TCT ATCT-3′，下游引物5′-CAA CCA CTC ACC TTC TAA ATT GAC ATT-3′，DNA探针5′-A(FAM)AC AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CA(TAMRA)A-3′，探针3′端阻断，避免反应过程中延伸。
1.2.3 以荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线(HRM)分型 PCR采用ABI公司生产的5700型PCR扩增仪。PCR缓冲液、dNTP、rTaqDNA 聚合酶等由TaKaRa 公司生产。反应体系中上下游引物浓度比为1∶10，反应体系10 μL,上游引物终浓度0.3 pmol,下游引物终浓度3 pmol,探针3 pmol,PCR扩增长度163 bp,探针与T特异互补。循环参数：95 ℃将DNA预变性2 min，95 ℃变性15 s，72 ℃延伸10 s，60 ℃复性20 s,55个反复循环扩增，后进入溶解曲线，60～95 ℃。采用荧光定量PCR仪Roche Light Cyclery®480软件分析溶解曲线，得出基因型。纯合子用TT、CC表示，杂合子用TC表示。等位基因频率=(2×纯合子+杂合子)/(2×受体人数)。
1.2.4 基因测序验证 将DNA 模板抽样共10例，经PCR法对IL-1RN-2018基因目的片段进行扩增，扩增长度163 bp,引物同前，PCR反应总体系为50 μL，包括dNTP 4.0 μL(2.5 mmol/L)，Tap 0.25 μL,10×PCR缓冲液5 μL,上下游引物(10.0 μmol/L)各4 μL，模板DNA各4 μL，用灭菌去离子水补充至50 μL，反应条件：95 ℃将DNA预变性2 min，95 ℃变性15 s，72 ℃延伸10 s，56 ℃退火30 s,35个反复循环，再于72 ℃延伸5 min;PCR扩增产物送上海生工生物公司进行DNA测序，结果与荧光定量PCR结果相符。
1.2.5 血清IL-1Ra、IL-1β水平测定 抽取NSCLC组及对照组患者静脉血3 mL，以3 000 r/min离心处理10 min，留取血清。采用ELISA法进行测定，试剂盒由上海生物试剂有限公司提供，操作过程严格按照试剂盒说明书进行操作。
2 结 果
2.1 HRM分型及DNA测序结果 IL-1RN-2018位点基因型分为TT、TC及CC 3种基因型，见图1、2。
图1 IL-1-RN-2018位点HRM分型结果
2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测 经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测IL-1RN-2018基因rs419598位点，对照组和NSCLC组基因型的实际值和预测值结果差异无统计学意义(P>0.05)，本实验样本具有代表性及可比性。
2.3 NSCLC组与对照组IL-1RN-2018基因多态性对比 IL-1RN-2018基因型及等位基因两组间差异有统计学意义(χ2=7.831，P=0.020)。分析结果表明，携带IL-1RN-2018位点的TC基因型人群发病危险性是携带TT基因型的2.646倍(95%CI：1.327～5.280)，TC+CC基因型人群发病危险性是携带TT基因型患者的2.315倍(95%CI：1.233～4.347)，差异均有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组携带C等位基因的比例明显高于对照组(χ2=4.562，P=0.033)，见表1。
2.4 NSCLC组鳞癌患者与腺癌患者基因型对比 鳞癌与腺癌患者IL-1RN-2018基因型及等位基因频率比较差异无统计学意义(χ2=0.074，P=0.964)。
A：T/T；B：T/C；C：C/C。
图2 IL-1RN-2018测序结果
2.5 NSCLC组与对照组各基因型血清中IL-1Ra对比 NSCLC组中患者血清IL-1Ra、IL-1β水平显着高于对照组，而IL-1Ra/IL-1β明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 NSCLC组与对照组血清中IL-1Ra、IL-1β及IL-1Ra/IL-1β的比较(±s，pg/mL)
2.6 不同病理类型NSCLC患者血清IL-1Ra表达水平对比 虽然鳞癌患者的血清IL-1Ra水平高于腺癌(P<0.05)，但IL-1Ra/IL-1β在两种病理类型的患者中未见明显差别(P>0.05)，见表3。
表3 鳞癌与腺癌患者血清中IL-1Ra、IL-1β及IL-1Ra/IL-1β的比较(±s，pg/mL)
2.7 NSCLC组中不同基因型患者的血清IL-1Ra水平的比较 NSCLC组中TT、TC、CC型患者的血清IL-1Ra水平差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨 论
肺癌发生的微环境中包含一部分炎症细胞，这些细胞可以产生一些细胞因子、生长因子，以及促进肿瘤发展及转移的黏附因子等，而IL-1是引起肿瘤免疫反应重要的细胞因子。IL-1有2个结构亚型,为IL-1α和IL-1β,是肿瘤免疫中的重要细胞因子，其可刺激细胞产生IL-6、血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子，从而诱导肿瘤细胞的移动、增殖，还可刺激内皮细胞增殖与分裂，增强基质蛋白酶活性，从而促进血管生成，参与NSCLC的生长、浸润和转移过程[5-6]。IL-1β、IL-6及TNF-α等多种细胞因子及趋化因子可活化核因子-κB，继而易位到细胞核，诱导与肿瘤相关的基因表达[7]。IL-1Ra可由中性粒细胞及单核巨噬细胞产生，可竞争性地与IL-1受体结合，阻断信号转导，进而特异地抑制IL-1的生物学功能，从而抑制肿瘤生长[4]。
肺癌的发生、发展受多种因素影响，宿主的基因多态性的影响不容忽视，IL-1Ra的编码基因IL-1RN存在多基因位点的多态性，目前多项研究表明IL-1RN的VNTR区的2等位基因可减低肺癌的发病、进展和转移[7-9]。而目前IL-1RN其他基因位点与肺癌的关系研究较少。
本研究对IL-1RN-2018位点进行了研究，结果显示NSCLC组患者CT型、CC型及CT+CC型比例显着高于对照组，C等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，TC基因型人群发病危险性是携带TT基因型的2.646倍，TC+CC基因型人群发病危险性是携带TT的携带者2.315倍，提示IL-1RN-2018 C基因的携带者NSCLC的患病风险增加。进一步比较鳞癌与腺癌之间差异无统计学意义(P>0.05)。该位点的基因多态性与多种肿瘤的发生密切相关，Burada等[10]对结肠癌的研究结果显示IL-1RN-2018 CC基因型与大肠癌的早期发病存在明显的相关性，Al-Moundhri等[11]研究结果显示IL-1RN-2018 CT及CT+CC基因型的胃癌发病率是TT基因型的2.6倍和2.2倍，C等位基因与胃癌发病相关。肺癌的发病可能与该基因的多态性相关，但各病理类型间无明显差别，表明宿主的基因因素可能影响肺癌的发病风险，但其发生可能涉及多途径、多因素共同作用的结果。
多种肺癌肿瘤标志物的检测应用到临床上，如CEA、NSE、CYFRA21-1、胃泌素释放肽前体(pro-GRP)等，有研究表明包括IL-1Ra、基质金属蛋白酶-2及TNF-α在内的炎症指标也可作为早期诊断肺癌的有效指标[12]。本研究结果显示NSCLC组的IL-1β及IL-1Ra水平均高于对照组，肿瘤引起的免疫反应可引起炎症因子水平的增加，但二者增加的水平不平行，NSCLC组中IL-1Ra/IL-1β比值明显低于对照组，多项研究表明IL-1Ra对肺癌的发生、进展存在一定的保护作用，IL-1Ra/IL-1β比值的降低可能增加NSCLC的风险。Shiels等[13]研究显示IL-1Ra的升高可降低肺癌的发病风险，且Bunt等[14]研究发现IL-1Ra生成缺陷的小鼠的肺癌的发病风险明显增加。有研究显示，给带瘤的小鼠注射缓释的IL-1Ra可延缓肿瘤的生长，这些结果均支持IL-1Ra对NSCLC存在一定的保护作用[15-16]。在肿瘤的发生、发展过程中IL-1β起促进作用，高水平的IL-1Ra更能有效与IL-1β竞争受体，从而阻断IL-1的生物活性，对肺癌的发生起到一定的保护作用。Bar等[15]研究显示包括IL-1Ra、基质金属蛋白酶-2及TNF-α在内的炎症指标可作为早期诊断肺癌的有效指标。此外，在霍奇金淋巴瘤、结肠肿瘤及妇科肿瘤患者血中都可检测到IL-1Ra增高[7]，因此，IL-1Ra及IL-1Ra/IL-1β可能作为非特异的肿瘤标志物进行包括NSCLC的检测。
IL-1Ra的产生和调节受多种因素的影响，如机体的免疫状态，各细胞因子间的相互作用及基因调节等，本试验结果显示NSCLC组各基因型患者的血清IL-1Ra水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明该基因位点可能不是IL-1Ra的产生原因，可能是其他基因位点的调节因素，如IL-1RN的VNTR的Ⅱ等位基因可使IL-1Ra的产生明显增加[10]，也有研究其产生可能受IL-1β基因的影响[16]，机体对各种物质的调节均有其复杂性，其调节机制有待进一步研究。
IL-1RN-2018的基因型检测及IL-1Ra/IL-1β比值的测定可能为早期识别肺癌发病的风险及尽早干预提供依据，但肺癌的发病机制复杂，还有待于加大样本量，多种族多地区联合，优化试验方法，进一步加以验证。
[1]De Groot P,Munden RF.Lung cancer epidemiology,risk factors,and prevention[J].Radiol Clin North Am,2012,50(5):863-876.
[2]Landvik NE,Hart K,Haugen A,et al.Functional analysis of a lung cancer risk haplotype in the IL 1B gene regulatory region[J].J Hum Genet,2012,57(11):747-752.
[3]Kaabachi S,Kaabachi W,Rafrafi A,et al.Tumor necrosis factor gene polymorphisms in Tunisian patients with non-small cell lung cancer[J].Clin Lab,2013,59(11/12):1389-1395.
[4]Melo Barbosa HP,Martins LC,Dos Santos SE,et al.Interleukin-1 and TNF-alpha polymorphisms and Helicobacter pylori in a Brazilian Amazon population[J].World J Gastroenterol,2009,15(12):1465-1471.
[5]Goldstraw P,Crowley J,Chansky K,et al.The IASLC Lung Cancer Staging Project:proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM Classification of malignant tumours[J].J Torac Oncol,2007,2(8):706-714.
[6]Yao PL,Lin YC,Wang CH,et al.Autocrine and paracrine regulation of interleukin-8 expression in lung cancer cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,32(6):540-547．
[7]Cheng CY,Hsieh HL,Sun CC,et al.IL-l beta induces urokinase-plasminogen activator expression and cell migration through PKC alpha,JNK1/2,and NF-kappaB in A549 cells[J].J Cell Physiol,2009,219(1):183-193．
[8]Hu Z,Shao M,Chen Y,et al．Allele 2 of the interleukin-1 receptor antagonist Gene (IL1RN*2)is associated with a decreased risk of primary lung cancer[J].Cancer Lett,2006，236(2)：269-275．
[9]Lim WY,Chen Y,Ali SM,et al.Polymorphisms in inflammatory pathway genes,host factors and lung cancer risk in Chinese female never-smokers[J].Carcinogenesis,2011,32(4):522-529.
[10]Burada F,Dumitrescu T,Nicoli R,et al.IL-1RN +2018 T>C polymorphism is correlated with colorectal cancer[J].Mol Biol Rep,2013,40(4):2851-2857.
[11]Al-Moundhri MS,Al-Nabhani M,Al-Bahrani B,et al.Interleukin-1beta gene (IL-1B) and interleukin 1 receptor antagonist gene (IL-1RN) polymorphisms and gastric cancer risk in an Omani Arab population[J].Gastric Cancer,2006,9(4):284-290.
[12]Farlow EC,Vercillo MS,Coon JS,et al.A multi-analyte serum test for the detection of non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer,2010,103(8):1221-1228.
[13]Shiels MS,Pfeiffer RM,Hildesheim A,et al.Circulating inflammation markers and prospective risk for lung cancer[J].J Natl Cancer Inst,2013,105 (24):1871-1880.
[14]Bunt SK,Yang L,Sinha P,et al.Reduced inflammation in the tumor microenvironment delays the accumulation of myeloid-derived suppressor cells and limits tumor progression[J].Cancer Res,2007,67(20):10019-10026.
[15]Bar D,Apte RN,Voronov E,et al.A continuous delivery system of IL-1 receptor antagonist reduces angiogenesis and inhibits tumor development[J]．FASEB J,2004,18(1):161-163．
[16]Vomnov E,Carmi Y,Apte RN.Role of IL-1-mediated inflananation in tumor angiogenesis[J]．Adv Exp Med Bid,2007,601(9):265-270．
Association between IL-1RN-2018 gene polymorphism and IL-1Ra/IL-1β with non-small cell lung cancer
LiJunrui1,XiaoYing2,FuYingju3,ZhangYali1,LuYujuan4,KangRuina1,ZhaoBaochun1
(1.DepartmentofInfectiousDisease;2.DepartmentofOncology;3.DepartmentofEmergency;4.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTangshanWorker′sHospitalofHebeiMedicalUniversity,Tangshan,Hebei063000,China)
Objective To investigate the association between interleukin receptor antagonist (IL-1Ra) encoded genes(IL-1RN-2018) polymorphisms and serum IL-1Ra/IL-1β with non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Totally 85 cases of NSCLC were selected as the NSCLC group and 80 cases of healthy physical examination were selected as the control group from January 2012 to January 2014.The IL-1RN-2018 T/C gene polymorphisms of the two groups were determined with the fluorescence quantitative PCR technique based on high resolution melting,10% randomly selected samples were sequenced to prove the accuracy.The levels of IL-1Ra and IL-1β of two groups were determined with ELISA.Results (1)The onset risk of NSCLC in TC and TC+CC genotypes on IL-1RN-2018 site in the NSCLC group were increased by 2.646 times and 2.315 times respectively compared with TT genotype,the difference had statistical significance(P<0.05).(2)No statistically significant difference of IL-1RN-2018 T/C were found between patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinomas(P>0.05).(3)The serum IL-1Ra and IL-1β levels in the NSCLC group were significantly higher than those in the control group,but IL-1Ra/IL-1β in the NSCLC group was significantly lower (P<0.05).(4)The serum IL-1Ra levels in the NSCLC group had no statistically significant difference among genotypes (P>0.05).Conclusion The C allele in IL-1RN-2018 site may increase the onset risk of NSCLC;the reduction of serum IL-1Ra/IL-1β may presage the risk of NSCLC.
interleukin 1 receptor antagonist;interleukin 1 bata;polymorphism;carcinoma,non-small cell lung
李君蕊(1974-)，硕士，副主任医师，主要从事感染科工作。
·临床研究
10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.020
R734.2
A
1671-8348(2015)14-1924-04
2015-01-10
2015-02-20)
