曾映娟，孙 莹，文江华，胡 芳，罗顺葵，鲁红云

（中山大学附属第五医院内分泌科，广东珠海519000）

清道夫受体A（scavenger receptor A，SR-A）是一种跨膜糖蛋白受体，参与氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）和高级糖基化终产物（AGEs）的摄取并且在调节炎性反应、细胞黏附、细胞凋亡等生理病理过程中起着重要作用。最近发现敲除SR-A 基因的小鼠对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾损害具有抵抗性，其24h尿清蛋白、肾小管间质损伤、浸润的巨噬细胞数目及转化生长因子β（TGF-β）的表达等均较同系野生型糖尿病小鼠明显减少，提示SR-A 是糖尿病肾病小管间质纤维化的危险因素之一。大量的研究证实血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）能延缓糖尿病肾病小管间质纤维化发展，但是否会对SR-A 的表达产生一定的作用目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 实验动物购自中山大学实验动物中心，STZ购自美国Sigma公司，培哚普利购自法国施维雅公司，大鼠尿清蛋白检测试剂盒购自美国Bethyl公司，羊抗鼠SR-A 多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学SP（法）试剂盒、DAB显色试剂盒、Masson三色染色试剂盒购自福州迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型的建立 用随机数字表将大鼠分为健康对照组（n＝9），糖尿病组（n＝9）和培哚普利干预组（n＝9）。糖尿病组与培哚普利干预组大鼠给予STZ（溶于0.1 mol／L、pH4.2的枸橼酸缓冲液）60mg／kg一次性腹腔注射，72h测血糖大于16.7mmol／L为模型制作成功；健康对照组给予等量的枸橼酸缓冲液一次性腹腔注射。培哚普利干预组给予培哚普利4mg·kg-1·d-1灌胃，健康对照组和糖尿病组给予等量饮用水。整个实验期间动物喂标准饲料，自由饮水，共观察24周。

1.2.2 一般生化指标和标本收集 每4周将大鼠放入代谢笼内留取24h尿液，记录尿量，按试剂盒书说明测定尿清蛋白，并检测每只大鼠的随机血糖和体质量；第24周测量体质量后处死大鼠，取出肾脏，计算肾脏质量／体质量比值。收集肾脏标本进行相关实验。

1.2.3 Masson染色 石蜡切片，常规脱蜡至水，Masson复合染色液染色，磷钼酸溶液染色，苯胺蓝染色，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定：每张切片随机选择10个视野，观察肾小管间质的病理变化，进行量化评分，0分：正常；1分：间质纤维化、炎症细胞浸润、肾小管萎缩、水肿、变性及小管管型等病变范围小于25%；2分：病变范围25%～＜50%；3分：病变范围≥50%；最后以平均值来表示该标本肾小管间质损伤指数［1］。

1.2.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测SR-A mRNA 的表达 按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，cDNA 的合成参照cDNA 第一链合成试剂盒说明操作，RT-PCR 反应按照SYBR GreenⅠPCR 试剂盒说明操作。大鼠特异性基因引物由Invitrogen公司合成，SR-A：正向引物5′-ACT TCA GCA TGG CAA CCG AC-3′，反 向 引 物5′-TGG AAA TTG CAT CCA GGG AC-3′，扩增片段长度105bp；内参基因采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），正向引物5′-AGG GCT GCC TTC TCT TGT GA-3′，反向引物5′-AAC TTG CCG TGG GTA GAG TCA-3′，扩增片段长度110bp。反应体系50μL，反应条件：93℃预变性3min；93 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延 伸30 s，40个循环，每个循环延伸后收集一次荧光；最后进行熔解曲线分析。阴性对照采用灭菌双蒸水代替cDNA，采用双标准曲线法相对定量，以SR-A 与内参基因表达量的比值来表示其相对表达水平。每个样品复孔3次，取平均值。

1.2.5 免疫组织化学染色 采用Eli Vision法。石蜡切片，常规脱蜡至水，抗原修复；3%过氧化氢灭活内源性酶；4 ℃过夜孵育一抗（美国Sata Cruz公司羊抗鼠SR-A，1∶200PBS 稀释）；使用免疫组织化学SP 试剂盒孵育二抗；DAB 溶液显色，阳性为棕黄色后终止显色；苏木素复染后中性树脂封片。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件处理数据，计量资料以±s表示，多组资料比较采用单因素方差分析和q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般指标比较 24周实验结束时，糖尿病组大鼠死亡1只，健康对照组与培哚普利干预组无大鼠死亡。糖尿病组大鼠的体质量低于健康对照组（P＜0.05），而肾脏质量／体质量比值、血糖和24h尿清蛋白均高于健康对照组（P＜0.05）；与糖尿病组比较，培哚普利干预组大鼠的体质量、肾脏质量／体质量比值、血糖差异均无统计学意义（P＞0.05），但24h尿清蛋白明显降低，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠一般指标比较（±s）

表1 各组大鼠一般指标比较（±s）

a：P＜0.05，与健康对照组比较；b：P＜0.05，与糖尿病组比较。

组别 n 体质量（g）肾脏质量／体质量（mg／g）尿清蛋白（mg／24h）血糖（mmol／L）健康对照组9 624±71 2.62±0.26 2.7±1.3 5.3±0.6糖尿病组 8 324±60a 5.59±0.74a 26.7±1.8a 26.7±3.3a培哚普利干预组 9 353±47a 5.46±0.81a 3.6±1.4b 26.2±2.0 a

2.2 肾脏的形态学改变 Masson染色可见健康对照组肾脏无明显病理改变，糖尿病组大鼠肾小管间质有严重组织损伤，表现为部分肾小管上皮细胞萎缩、空泡样变性，间质有较多的炎症细胞浸润，并出现肾间质纤维化，培哚普利干预组大鼠肾脏的上述病理改变较糖尿病组明显减轻。量化分析结果显示，糖尿病组（1.89±0.23）的肾小管间质损伤指数显着高于健康对照组（0.25±0.11）和培哚普利干预组（0.71±0.12），均P＜0.05。见图1。

图1 各组大鼠肾小管间质Masson染色（×200）

2.3 培哚普利干预对肾小管间质SR-A mRNA 表达的影响 RT-PCR结果显示糖尿病组大鼠肾脏SR-A mRNA 表达水平约为健康对照组的4倍（5.6±1.2vs.1.4±0.1，P＜0.05）；培哚普利干预组肾脏SR-A mRNA 表达显着低于糖尿病组（3.4±0.7vs.5.6±1.2，P＜0.05）。见图2。

2.4 培哚普利干预组对肾小管间质SR-A 蛋白表达的影响 免疫组织化学染色可见健康对照组大鼠肾小管上皮细胞和肾间质只有少量棕褐色的阳性着色；糖尿病组肾小管间质中阳性着色明显增多；与糖尿病组比较，培哚普利干预组的着色范围明显减少。见图3。

图2 各组大鼠肾脏SR-A mRNA 的相对表达

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾衰竭的最常见病因。研究显示，肾小管间质纤维化几乎是所有肾脏疾病发展到终末期肾病的共同通路，肾功能减退与小管间质的病变程度的联系比肾小球更密切，糖尿病肾病患者的远期预后主要取决于小管间质病变程度［2］。因此研究糖尿病肾病肾小管间质病变的机制，对改善其预后具有重要意义。

SR-A 是一种细胞表面的跨膜糖蛋白受体，最初从巨噬细胞上发现。在早期的动脉粥样硬化的研究中证实，SR-A 主要介导血液中化学修饰的脂质如ox-LDL 进入细胞内而不受控制最终造成泡沫细胞形成［3］。有研究发现肾小管上皮细胞也存在包括SR-A 在内的多种清道夫受体，而且可能与肾小管间质的损伤相关［4］。

许多与糖尿病肾病发病密切相关的因素如肾素-血管紧张素系统活性增加、非酶糖基化作用、氧化应激等均可以上调SR-A 表达。糖尿病肾病早期肾内肾素-血管紧张素系统（RAS）即被激活，局部血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）产生增加，AngⅡ可呈时间和剂量依赖性上调SR-A，这一作用是通过PKC信号传导途径实现的［5］。另外，长期高血糖状态加速蛋白质发生非酶促糖基化反应，肾组织内糖基化终产物（AGEs）蓄积增多，AGEs通过活化酪氨酸蛋白激酶后进一步激活磷脂酶C，最终激活NF-κB，而促进SR-A 的表达［6］。此外，糖尿病（尤其是糖尿病肾病）患者常伴有脂质代谢紊乱，血清中低密度脂蛋白（LDL）水平升高。在糖尿病状态下，体内氧化应激增强，LDL容易被氧化修饰为ox-LDL，ox-LDL与SR-A 的结合能够刺激巨噬细胞分泌前炎性因子和生长因子，这些因子反过来又刺激SR-A 的表达［3，7］。本研究中糖尿病大鼠肾小管间质SR-A 基因和蛋白质表达升高可能是上述因素共同作用的结果。

RAS激活在糖尿病肾病肾小管间质损害中起着重要作用，但具体机制尚不完全清楚。大量的基础实验及临床研究已证实使用ACEI阻断血管紧张素系统（RAS）对糖尿病肾病具有保护作用［1，8-12］。ACEI抑制AngⅡ生成，一方面能改善糖尿病肾脏血流动力学异常；另一方面也有降低微炎性反应，下调小管间质TGF-β表达，抗肾小管间质纤维化的作用［13］。本研究首次观察了ACEI类药物培哚普利干预对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏SR-A 表达的影响，发现培哚普利干预24周后，不仅降低24h尿清蛋白，减轻肾小管间质的病理学改变及巨噬细胞的浸润，而且显着下调SR-A 表达。但其抑制SR-A 表达的机制尚不清楚，除了减少尿蛋白带来的肾脏保护效应之外，不排除通过其他途径发挥作用。糖尿病肾病早期肾内RAS即被激活，小管间质局部AngⅡ产生增加［14］，而既往研究已在细胞水平上证实，AngⅡ可呈时间和剂量依赖性上调SR-A［5］，因此，培哚普利下调SR-A 表达的作用，可能与其阻断糖尿病肾组织局部的RAS活性，抑制AngⅡ生成过多有关，但其确切机制有待进一步研究。

总之，本研究观察到糖尿病大鼠肾小管间质SR-A 表达增加，ACEI类药物培哚普利可减少SR-A 的表达，改善糖尿病大鼠肾小管间质损伤。

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