张春容，陶 武
（重庆医科大学附属永川医院急诊科，重庆永川402160）
脓毒症（sepsis）多为全身或局部感染所诱发，激活的粒细胞是清除入侵病原体执行免疫防御的主要效应细胞。因其病情、病因多样且复杂，研究者们一直致力于寻找有效的生物标志物探寻可能的发病机制[1]。现有研究报道，除了杀菌蛋白外，中性粒细胞还存在第2种杀菌机制——释放由颗粒蛋白和DNA构成的中性粒细胞胞外诱捕网（cf-DNA／NETs）[2]，但cf-DNA／NETs在sepsis患者中报道还较少。为进一步阐述sepsis可能的机制，本研究据此设计，拟探讨cf-DNA／NETs在sepsis患者中的表达及意义，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 纳入2014年3月至2015年1月于本院就诊的sepsis患者42例（sepsis组），诊断均符合美国胸科医师协会／美国危重症医学学会在美国华盛顿联合会议对sepsis的诊断标准。另纳入非感染引起的全身炎症反应综合征患者36例（non infection SIRS，nf-SIRS组）。纳入30例健康体检者作为对照组（control组）。排除标准：年龄小于18岁；妊娠状态或哺乳期妇女；合并人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者；恶性肿瘤者；免疫抑制（包括长期使用激素治疗和放化疗等）；入组24h内死亡者；患者或家属不同意参加此项研究者。对照组纳入时排除1周前有发热、咳嗽咳痰或体检时有白细胞（WBC）升高等可疑感染征象者。3组受试者在年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。与control组比较，sepsis组和nf-SIRS组体温显着升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。
1.2 方法
1.2.1 标本采集与检测 于第1、3、7天7：00～9：00采集血液样本于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，-80℃保存待测。cf-DNA／NETs检测同文献报道，采用基于PicoGreen荧光染料的方法，采用ModulusTM单管型多功能检测仪进行检测，范围在50～3 000ng／mL[2]。将标准品小牛胸腺嘧啶DNA干粉倍比稀释后加入PicoGreen工作液并混匀，使用ModulusTM单管型多功能检测仪Blue荧光模块检测其荧光值。以标准品溶液的浓度与对应的荧光强度作直线回归，并制标准曲线。将待测血液样本与PicoGreen工作液混匀，检测其荧光值，代入标准曲线即求得样本cf-DNA／NETs水平。
1.2.2 资料收集 收集3组受试者的人口学资料。收集患者各项临床资料和实验室检测结果，包括体温、影像学资料、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、WBC、中性粒细胞（N）比例等。对患者进行急性生理及慢性健康评估（APACHEⅡ）量表检测。
表1 3组受试者第1天各实验室检测指标比较（±s）
表1 3组受试者第1天各实验室检测指标比较（±s）
＊：P＜0.05，与control组比较；＃：P＜0.05，与nf-SIRS组比较。
组别 n CRP（mg／L）PCT（ng／mL）WBC（×109／L）N（%）cf-DNA／NETs（ng／mL）control组 30 6.2±1.6 0.01±0.05 5.4±3.7 78.4±10.4 76.2±34.7 sepsis组 42 47.2±22.4＊ 5.10±6.80＊＃ 13.4±4.6＊ 96.8±7.6＊ 1 576.0±254.0＊nf-SIRS组 36 51.8±18.9＊ 1.20±1.70＊ 11.8±5.8＊ 92.5±7.3＊ 596.0±183.0＊＃
表2 两组患者PCT和cf-DNA／NETs在各时间点表达情况（±s，ng／mL）
表2 两组患者PCT和cf-DNA／NETs在各时间点表达情况（±s，ng／mL）
＃：P＜0.05，与nf-SIRS组比较。
组别 n PCT第1天 第3天 第7天NETs第1天 第3天 第7天cf-DNA／sepsis组 42 5.1±6.8＃ 2.7±7.3＃ 0.7±1.1 1 576±254＃ 1 443±389＃ 1 389±673＃nf-SIRS组 36 1.2±1.7 0.8±0.8 0.4±0.6 596±183 582±137 474±122
1.3 统计学处理 所有数据录入Excel表格，使用Graph pad5.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较使用单因素方差分析（one-way anove）。计量资料组间比较使用Fisher确切概率法。双侧检验效能，以P＜0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 实验室检测指标比较 与control组比较，sepsis组和nf-SIRS组各项炎症指标均显着升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。sepsis组PCT和cf-DNA／NETs水平显着高于nf-SIRS组，两组在CRP、WBC和N比例等一般感染指标上差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。
2.2 各组在不同时间点的cf-DNA／NETs表达 在入组后第1、3天，两组患者间PCT和cf-DNA／NETs水平仍维持显着差异状况。而在治疗后第7天，sepsis患者血浆PCT水平将至0.7ng／mL，nf-SIRS组为0.4ng／mL，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。sepsis组cf-DNA／NETs并未随着时间的推移显着降低，在第7天时仍维持较高水平，与nf-SIRS组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
2.3 治疗7d后亚组分析 在治疗后第7天，sepsis组有5例患者各项指标恢复正常，考虑近日出院进行院外随访（A组）。24例患者体温恢复正常，不再发热，但临床症状提示有感染可能（B组）。另13例患者仍发热，最低体温高于37.8℃，细菌学检查提示有确切的致病菌（C组）。nf-SIRS组与A组结果类似，两组间各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。与前两组比较，B、C组cf-DNA／NETs均处于较高水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；而PCT值仅在C组表现为显着增高，与各组均有统计学差异（P＜0.05），见表3。
表3 治疗后7d临床亚组分析PCT和cf-DNA／NETs表达（±s，ng／mL）
表3 治疗后7d临床亚组分析PCT和cf-DNA／NETs表达（±s，ng／mL）
a：P＜0.05，与nf-SIRS组比较；b：P＜0.05，与A组比较；c：P＜0.05，与B组比较。
36 0.40±0.60 474±122组别 n PCT cf-DNA／5 0.23±0.36 351±117 B组 24 0.52±0.65 1 462±140ab C组 13 1.34±0.73abc 1 649±216ab nf-SIRS组NETs A组
3 讨论
Brinkmann等[3]首次报道炎性期激活的N能够形成cf-DNA／NETs，其主要成分为DNA、抗菌肽与颗粒源性蛋白质。cf-DNA／NETs结构中富含组蛋白，包括组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4。颗粒源性蛋白质有嗜苯胺蓝颗粒中的N弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、组织蛋白酶G，以及其他特异性颗粒蛋白质。Pilsczek等[4]报道，N在形成NETs应答金黄色葡萄球菌反应时，整个过程非常迅速（5～60min）。Wartha等[5]指出，N死亡时释放cf-DNA／NETs是一种不同于细胞凋亡或死亡的新的细胞死亡途径，这种细胞死亡程序称为ETosis。细胞经ETosis表现为细胞核膜崩解，细胞核和细胞质混合，细胞器消失，并在胞外形成纤维样诱捕网结构。三维网状结构的cf-DNA／NETs不仅可在病灶部位募集高浓度杀菌肽，还可利用其独特的物理结构阻止病原体的扩散[6]。带正电荷的cf-DNA／NETs组分与带负电荷的病原体之间的电荷吸引是发生捕获的可能机制[7]。
本研究与报道一致，在疾病早期即有cf-DNA／NETs的显着升高。而且cf-DNA／NETs的表达有一定特异性，在感染引起的sepsis患者可高达1 576ng／mL，在非感染引起的SIRS患者仅轻度增高为596ng／mL。本研究还发现，cf-DNA／NETs的水平似乎和血液中WBC的数量和N比例并无相关性，因为sepsis组和nf-SIRS组患者这两项指标差异并不明显。虽然sepsis组和nf-SIRS组存在着是否发生感染的根本病因，但两组患者的CRP差异无统计学意义（P＞0.05），能反映两组间区别的仅为PCT和cf-DNA／NETs。进一步分析两组患者各时间点的PCT和cf-DNA／NETs表达情况发现，PCT会随着治疗不断下降，到第7天时两组已无显着差异，但两组患者此时的临床表现往往差异很大，sepsis患者体内病灶并未完全消散。治疗7d后对sepsis组按疗效和临床症状进行亚组分析发现，而cf-DNA／NETs不管是在疾病早期还是晚期，表达都较为稳定，其水平不会随着治疗和时间改变（C组），而更多的是与机体的感染情况相关（B组），较PCT更能客观地反映患者机体内抗菌水平。对于与nf-SIRS患者表现类似的B组患者，虽然体温恢复正常，PCT差异无统计学意义（P＞0.05），但临床高度怀疑仍有残留的感染灶，持续高水平的cf-DNA／NETs是有力证据。对于后期sepsis患者，B组患者依靠常规指标难以与nf-SIRS患者区分出来，是进行cf-DNA／NETs检测的主要受益者。
CRP是肝脏细胞在IL-6作用下分泌产生的一种急性时相蛋白，在应激情况下增高。张敏等[8]报道以nf-SIRS为对照，CRP具有一定早期诊断sepsis的价值，这与本报道有出入的地方，可能是因为纳入的患者存在人群差异。sepsis患者有病情轻重的差异，患者分层分布的差异可能是造成这种结果的重要原因。有研究报道，PCT有对于早期诊断sepsis和判断病情轻重有较好的价值，诊断的特异性和敏感性分别为80%和76%[9]。但研究者多局限于早期观察PCT的诊断价值，并未对PCT的变化进行动态随访。本研究拉长了观察时间，发现随着药物的应用，PCT已不能准确反映患者后期的状态。对于此时的综合评估，cf-DNA／NETs更客观恰当。
cf-DNA／NETs是与机体感染更密切相关的指标。因为cf-DNA／NETs是由多种细菌及其组分LPS刺激粒细胞活化产生，且机体接受整个病原体的刺激要比其单一组分如LPS的刺激能生成更多的NETs[10]。目前研究发现，NETs多在有病原体入侵的感染部位发生。Lögters等[11]通过研究关节滑液中cf-DNA／NETs水平与脓毒性关节炎的关系，发现脓毒性关节炎患者关节滑液cf-DNA／NETs水平比非感染性关节炎或骨关节炎患者显着升高。因为DNA是NETs的主要构成成分，NETs可因DNA酶而非蛋白酶的作用水解。以rhDNase干预可阻碍机体的早期免疫反应，加重多种微生物引起的败血症病理改变[12]。
综上所述，cf-DNA／NETs和PCT一样，不仅在早期诊断sepsis方面有一定价值，而且在后期辨别sepsis与nf-SIRS方面更优于PCT。在sepsis病程全期，均可以cf-DNA／NETs表达情况来评估患者感染情况，指导临床治疗。
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