董 静，陈 萍，刘 丹，吕艳欣，梅庆步，张明龙，郑立红

(齐齐哈尔医学院生物遗传教研室，黑龙江齐齐哈尔 161000)

论着·临床研究

白细胞介素基因多态性与乳腺癌遗传易感的相关性分析*

董 静，陈 萍，刘 丹，吕艳欣，梅庆步，张明龙，郑立红△

(齐齐哈尔医学院生物遗传教研室，黑龙江齐齐哈尔 161000)

目的探讨白细胞介素-10(IL-10)基因多态性(SNPs)与乳腺癌遗传易感的相关性。方法采集齐齐哈尔医学院附院乳腺癌患者血样156例作为病例组，抽取健康者血样156例作为对照组。经过基因组DNA提取、PCR扩增等一系列反应，使用时间飞行质谱对IL-10-592、-1082位点进行基因分型及多态性分析。最终通过统计学分析乳腺癌患者与健康者之间的差异。结果两组的IL-10-592位点均存在C/C、C/A、A/A 3种基因型，比较分布不存在显着差异无统计学意义(χ2=3.26，P>0.05)。两组的IL-10-1082位点均存在G/G、G/A、A/A基因型，比较分布存在差异，病例组G/G、G/A基因型多于对照组，差异有统计学意义(χ2=14.07，P<0.01)。在Logistic多元回归分析中发现，与IL-10-592 A/A基因型比较，携带IL-10-592 C/A、C/C基因型的群体发生乳腺癌的危险性分别为OR=1.039(95%CI：0.484～2.233)，P=0.922，OR：1.635(95%CI=0.683～3.915)，P=0.270，差异均无统计学意义。与IL-10-1082 A/A比较，表达IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群体发生乳腺癌的危险性分别为OR=0.424(95%CI：0.210～0.855)，P=0.016，OR=0.455(95%CI：0.178～1.163)，P=0.100。结论IL-10-592 位点基因多态性可能与乳腺癌遗传易感不相关。IL-10-1082 G/A基因型的表达可能是乳腺癌遗传易感的一个保护因素。

白细胞介素10；乳腺肿瘤；基因多态性

全球乳腺癌发病率较高，据国家癌症中心和国家卫生部疾病预防控制局统计显示[1]：乳腺癌发病率已占据女性恶性肿瘤第一位，且各地区发病率无明显差异[2]。乳腺癌的发病机制至今尚未明确，但根据多项调查发现遗传、免疫等均为乳腺癌的高危因素[3]。欧美等国家通过大量研究发现大量乳腺癌相关的易感基因，如BRCA-1/2、p53、PTEN等[4]。本次研究选择了乳腺癌患者白细胞介素-10(IL-10)启动子区-592、-1082位点的基因多态性进行研究，通过基因测序进行统计分析，以论证IL-10基因多态性与乳腺癌遗传易感的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集2013年1月至2014年6月齐齐哈尔医学院附属医院收治的乳腺癌患者血样156例作为病例组，均为女性，平均年龄(45.73±7.69)岁。另采集同期体检健康者血样156例作为对照组，均为女性，平均年龄(43.91±7.16)岁。根据国际抗癌联盟(UICC)[5]及世界卫生组织(WHO)[6]标准进行评定。病例组中乳腺癌患者均为首次发现就诊，经病理学诊断确诊，排除其他肿瘤类疾病。对照组既往均无乳腺肿瘤及其他类肿瘤疾病。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物制备 采集清晨空腹血1 mL，肝素抗凝，使用全血基因组小剂量试剂盒提取DNA后进行DNA质量检测及浓缩纯化。根据IL-10的单核苷酸多态性(SNP)位点，用iPLEX GOLD设定IL-10-592(rs1800872)、IL-10、-1082(rs1800896)的引物。见表1。

1.2.2 PCR扩增及单碱基延伸 使用7900PCR扩增仪(ABI)进行PCR扩增，反应体系5.0 μL：MgCl2，0.5 μL，1×；底物混合物0.1 μL，2 mmol/L；引物混合物1.0 μL，100 nmol/L；反应酶0.2 μL，1.0 U；水1.8 μL。循环参数：94 ℃，900 s；94 ℃，20 s；56 ℃，30 s；72 ℃，60 s，45次循环；72 ℃，180 s；4 ℃存放。按照iPLEX GOLD建议[7]进行单碱基延伸。

表1 引物序列表

1.2.3 飞行质谱基因分型[8]PCR的产物在单碱基延伸后收集纯化的DNA，使用SCMS-IT-TOF飞行时间质谱分析仪进行基因表型分析，SEQUENOM软件对单碱基延伸产物质谱峰位置确定分子质量，得出SNP分型结果，并根据质谱峰的信噪比、峰尖位置、峰宽度判定分型结果质量值。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0进行统计学处理，应用χ2检验比较并分析基因型及等位基因分布。应用Logistic多元回归分析各基因型与乳腺癌遗传易感的相关性。检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因型及频率分布 经分析两组的IL-10-592位点均存在C/C、C/A、A/A 3种基因型，比较分布差异无统计学意义(χ2=3.26，P>0.05)。两组的IL-10-1082位点均存在G/G、G/A、A/A基因型，病例组G/G、G/A基因型多于对照组，差异有统计学意义(χ2=14.07，P<0.01)，见表2。

表2 基因型及频率分布[n(%)]

2.2 基因型频率Hardy-Weinberg平衡检验 本研究中所得的实际值，与预测值进行比较，经χ2检验病例组与对照组中各基因型实际值与预测值分布不存在差异(P>0.05)，仅病例组中IL-10-1082位点基因型分布存在差异(P<0.05),基本符合Hardy-Weinberg 平衡，证实了本研究的群体符合遗传学规律，具有代表性，见表3、表4。

2.3 各基因位点与乳腺癌遗传易感相关性分析 对本研究中所得结果使用Logistic多元回归分析，以验证IL-10-592与IL-10-1082各位点与乳腺癌遗传易感的相关性。与IL-10-592 A/A基因型比较，表达IL-10-592 C/A、C/C基因型的群体发生乳腺癌的危险性分别为OR=1.039，95%CI：0.484～2.233，P=0.922，OR=1.635，95%CI：0.683～3.915，P=0.270，差异均无统计学意义。与IL-10-1 082 A/A比较，表达IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群体发生乳腺癌的危险性分别为OR=0.424，95%CI：0.210～0.855，P=0.016，OR=0.455，95%CI：0.178～1.163，P=0.100。即IL-10-1082 G/A基因型表达可能降低乳腺癌发病的风险，见表5、6。

表3 IL-10-592位点基因型频率平衡检验

表4 IL-10-1 082位点基因型频率平衡检验

表5 IL-10-592 位点多态性与乳腺癌遗传易感的危险性分析

表6 IL-10-1082 位点多态性与乳腺癌遗传易感的危险性分析

3 讨 论

乳腺癌作为全球高发的一类恶性肿瘤，其发病与遗传、环境等因素关系密切，但其发病的分子机制尚未确切，对于细胞因子基因多态性的研究逐渐深入。IL-10属于干扰素家族的细胞因子合成抑制因子，它可抑制Th1细胞合成干扰素-γ、TNF-α等[9-10]。其是一种具有免疫活力的免疫细胞调节因子，具有刺激、抑制免疫的双重作用[11-12]。其可增强B细胞的增殖、分化，上调MHC-Ⅱ的表达，也可以抑制单核细胞MHC-Ⅱ的表达，下调T细胞活性。由于作用的靶细胞不同，IL-10表现出不同的效用，其双向表现是机体免疫调节的关键[13-14]。IL-10启动子区存在转录因子，影响其水平的表达，因此启动子区基因多态性的研究是目前基础研究的热门[15-16]。

国内外对于白细胞介素的研究众多。方琦[17]在对原发性乳腺癌组织中IL-8的基因表达研究中发现IL-8相对表达高时乳腺癌患者生存期较短，且IL-8表达可能为乳腺癌预后的独立危险因素。刘继永[18]发现IL-1B T-31C、C-511T的多态性改变可能会增加中国人群乳腺癌发病概率，在其多层分析中也发现月经情况可能影响IL-8基因多态性与乳腺癌易感的关联。宋新宇等[19]研究中发现IL-10可能通过抑制树突状细胞的产生及分化而抑制机体对肿瘤细胞的免疫作用。有文献证实了IL-10在协助乳腺癌细胞逃脱免疫攻击上可能起着重要作用[20]。相反的是，Smith等[21]研究阐述IL-10等细胞因子与乳腺癌的易感性无明显关系。且张国强等[22]的Meta分析未能证明IL-10基因多态性与乳腺癌易感相关。

3.1 IL-10-592位点多态性分析 本研究中，分析结果显示，在病例组中IL-10-592 C/C、C/A、A/A位点各基因型频率分别为28.2%、50.0%、21.8%，与对照组比较无显着差异，不具有统计学意义(P>0.05)。在Logistic多元回归分析中发现，与IL-10-592 A/A基因型比较，表达IL-10-592 C/A、C/C基因型的群体发生乳腺癌的危险性分别为OR=1.039，OR=1.635，差异均无统计学意义(P>0.05)。即细胞因子IL-10-592 位点多态性的改变可能与乳腺癌的易感不相关。而在相关研究领域中，Cheong等[23]发现IL-10启动子区-592 A等位基因与乙型肝炎易感可能相关。

3.2 IL-10-1082位点多态性分析 IL-10-1082位点多态性在乳腺癌患者与健康人群中分布各异，Giordani等[24]及Gonullu等[25]研究发现IL-10-1082位点的多态性与乳腺癌易感性相关，在病例组各基因型频率与对照组比较，病例组G/G、G/A基因型多于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。在Logistic多元回归分析中发现，与IL-10-1082 A/A比较，表达IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群体发生乳腺癌的危险性分别为OR=0.424，P=0.016，OR=0.455，P=0.100。表达IL-10-1082 G/A基因型患乳腺癌的概率是A/A基因型群体的0.424倍，G/A基因型为乳腺癌遗传易感的保护因素，可以降低患乳腺癌的风险，差异有统计学意义(P<0.05)。即细胞因子IL-10-1082 G/G基因型表达可能与乳腺癌易感不相关，而IL-10-1082 G/A基因型表达可能降低乳腺癌发病的风险。而Smith等[21]及Balasubramanian等[26]等研究结果却相反，他们发现该类细胞因子与乳腺癌易感性无明显关系。

综上，本研究中并不能证明IL-10基因多态性的改变与乳腺癌遗传易感相关，但IL-10-1082 G/A基因型表达可能是乳腺癌发病的一个保护因素，这与既往IL-10-1082 G/A基因多态性在乳腺癌的易感性方面扮演某种角色的说法[27-28]相印证，而与张国强等[22]的Meta分析中的结果相悖。对于白细胞介素与乳腺癌遗传易感的相关研究相对较少，样本量较小也可能影响研究结果的准确度，对于二者的相关性尚需进一步研究。

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Analysis of the relationship between interleukin SNPs and breast cancer susceptibility*

DongJing，ChenPing,LiuDan,LvYanxin,MeiQingbu,ZhangMinglong,ZhengLihong△

(DepartmentofBiologicalHeredity,QiqiHaerMedicalUniversity，QiqiHaer，Heilongjiang161000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between IL-10 SNPs and breast cancer susceptibility.MethodsCollected 156 blood samples of breast cancer patients as case group and 156 blood samples of health as control.Genotype SNPs of IL-10-592,-1082 were analyzed by genomic DNA extraction，PCR amplification and TOF mass spectrometry.The data was used by statistical analysis.ResultsIL-10-592 C/C,C/A and A/A site the genotype frequencies were not diversity between two groups(χ2=3.26，P>0.05).IL-10-1082 G/G、G/A、A/A site the genotype frequencies were statistically significant between two groups(χ2=14.07，P<0.01).In Logistic multivariate regression analysis found that：be compared with IL-10-592 A/A,carrying IL-10-592 C/A,C/C group respectively the risk of breast cancer wereOR=1.039(95%CI:0.484-2.233),P=0.922,OR=1.635(95%CI:0.683-3.915),P=0.270,which had no statistical significance.In Logistic multivariate regression analysis found that：be compared with IL-10-1082 A/A,carrying IL-10-1082 G/A、G/G group respectively the risk of breast cancer wereOR=0.424(95%CI:0.210-0.855),P=0.016,OR=0.455(95%CI:0.178-1.163),P=0.100.ConclusionIL-10-592 may be not associated with breast cancer susceptibility.IL-10-1082 G/A may be a protection factor with breast cancer susceptibility.

interleukin-10;breast neoplasms;gene polymorphism

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.019

黑龙江省教育厅面上项目(12541903)。

：董静(1987-)，硕士，助教，主要从事抗肿瘤研究。△

，Tel:18045289390；E-mail:zhenglihong0zlh@sina.com。

R737.9

A

1671-8348(2015)29-4086-03

2015-04-18

2015-08-16)