穆 旭，李 金
(1.首钢工学院基础部，北京100041；2.北京建筑大学体育部，北京100044)
论着·基础研究
肉桂酸对小鼠运动疲劳的实验研究
穆 旭1，李 金2
(1.首钢工学院基础部，北京100041；2.北京建筑大学体育部，北京100044)
目的 探讨肉桂酸对提升小鼠运动耐力的影响。方法通过建立力竭性游泳来建立小鼠力竭性运动模型，比较安静对照组、运动训练组和运动给药组小鼠力竭游泳持续时间，血浆中乳酸(LAC)含量来探讨肉桂酸对小鼠的耐力提升；检测肝脏组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化酶(CAT)的含量来探讨肉桂酸的抗氧化能力，通过Western blot方法检测肉桂酸对小鼠股四头肌中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶表达水平来进一步研究其对小鼠运动能力提升的影响。结果肉桂酸显着延长小鼠的游泳时间；运动给药组与安静对照组比较：血浆LAC含量虽然有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，肝脏组织匀浆中SOD和CAT显着下降(P<0.05)，MDA显着上升(P<0.01)，CAT虽下降但差异无统计学意义(P>0.05)，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的表达水平显着下降(P<0.01)；运动训练组与安静对照组比较，血浆LAC含量显着升高(P<0.01)，肝脏组织匀浆中SOD和CAT显着下降(P<0.01)，MDA显着上升(P<0.01)，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的表达水平显着降低(P<0.01)；运动给药组与运动训练组比较，血浆LAC含量显着降低(P<0.01)，肝脏组织匀浆中SOD和CAT显着上升(P<0.01)，MDA显着下降(P<0.01)，CAT显着下降(P<0.01)，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的表达水平显着降低(P<0.05)。结论肉桂酸具有良好的抗氧化能力和抗疲劳能力。
肉桂酸；运动耐力；抗氧化
运动员在运动和训练中经常产生缺氧、缺血及疲劳，使机体耐力下降。如何消除剧烈运动后体内过量的自由基，延缓和抵抗运动性疲劳的产生，同时提高运动成绩，成为运动医学者们研究的重要课题。有针对地使用运动保健品对提高运动训练效果和运动成绩具有重要的意义，比如辣椒素、辣椒素脂等[1-3]。肉桂酸(cinnamic acid)即3-苯丙烯酸(3-phenyl-2-propenoic acid)，又称桂皮酸、桂酸。是从植物中提取的一种天然芳香族有机酸，无毒性[4]，目前广泛应用于药品、香料、农药等，具有抗菌[5]、利胆[6]、抗肿瘤[7]的作用。目前，在运动科学领域，You等[8]将肉桂酸衍生物——阿魏酸用于增强人和竞技用马的竞技能力，发现加入肉桂酸衍生物可以增强举重运动员的肌肉强度[8]；Lee等[9]通过研究指出肉桂酸本身具有抗氧化的作用，虽然肉桂酸对健康的好处受到了大量的关注，但其对力竭性运动能力的影响的研究还相对较少。因此，本研究拟通过建立小鼠力竭游泳运动损伤模型，观察肉桂酸注射剂对力竭训练小鼠抗氧化能力及腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)酶代谢的影响，为肉桂酸应用于运动保健领域提供实验依据，为其今后在竞技体育运动中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 肉桂酸购自Sigma公司(美国)。
1.1.2 实验动物 健康8周龄ICR雄性小鼠30只，体质量(18.72±0.738)g，由天津中医药大学医学动物实验中心提供。
1.1.3 实验药品 乳酸(BLAC)试剂盒、丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、超微量Na+/K+-ATP试剂盒、超微量Ca2+/Mg2+-ATP酶均购自上海源叶生物技术有限公司；ATP单克隆抗体购自Cell Signaling公司，β-actin单克隆抗体购自武汉博士德公司，二抗购自Invitrogen公司。
1.1.4 主要仪器 小鼠恒温游泳池[90 cm×60 cm×45 cm，水温(2.8±1.0)℃，水深38 cm，底部安装有水泵形成流动水流，流速7.5 L/min]，MP200A型电子天平购自上海第二分析仪器厂，Nanodrop微量紫外分光光度计(Thermoscientific公司)、FSH-2高速电动匀浆机、DL-46RC低速冷冻离心机购自中科生物医学高科技开发公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将购入的小鼠适应性饲养1周后，按随机数字法随机分为安静对照组、运动训练组、运动给药组，每组10只。
1.2.2 动物饲养 动物饲养室温(25±2)℃，湿度45%～55%，自然昼夜规律照明,各组每日给予基础饲料，自由饮水。
1.2.3 动物给药 根据前期预实验中结果，发现当肉桂酸为250 μmol/kg时效果最佳，精密称取肉桂酸粉末0.037 g溶于3.5% NaCl溶液，经20 U微孔滤膜高压蒸汽灭菌15 min制成注射剂，按照体质量从尾静脉给药，1 mL/10 g小鼠体质量。正式实验开始，运动给药组小鼠在每天下午3：00～4：30从尾静脉注射肉桂酸针剂，其他两组小鼠从尾静脉注射等体积的生理盐水，持续14 d。
1.2.4 力竭游泳训练模型的建立 实验前，对3组小鼠的体质量和无负重力竭游泳时间进行测定。力竭判定标准[10]：小鼠头部全部入水持续10 s不能浮出水面，捞出后平放在水平面上，不能完成翻正反射。运动给药组小鼠在每天下午3：00～4：30从尾静脉注射肉桂酸针剂，其他两组小鼠从尾静脉注射等体积的生理盐水，1 h后进行力竭游泳训练。安静对照组正常活动，持续训练14 d，隔天进行1次无负重力竭游泳训练[10]。最后一次力竭游泳时，专人记录小鼠力竭游泳时间。
1.2.5 指标检测 最后一次力竭游泳后记录各组小鼠力竭游泳时间。3.5%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，约2 mL，肝素抗凝，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液按照BLAC试剂盒说明书要求做ELISA检测小鼠血浆中LAC的含量；取肝脏，生理盐水冲洗后称质量，按照1∶9的比例加入生理盐水，冰浴下用匀浆机匀浆，7 500 r/min低速冷冻离心机离心15 min，吸取上清液，按照试剂盒说明书要求采用ELISA法对小鼠肝脏中SOD、MDA和CAT的含量进行检测；取小鼠股四头肌，生理盐水冲洗后称质量，按照1∶9的比例加入生理盐水冰浴下用匀浆机匀浆，7 500 r/min低速冷冻离心机离心15 min，吸取上清液，Nanodrop微量紫外分光光度计测定蛋白含量，各孔的蛋白上样总量一致，均为100 μg。电泳浓缩胶80 V，50 min，分离胶110 V，150 min。经过10%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后，110 V，5 mA转膜120 min，将蛋白转移至PVDF膜上。室温含25%脱脂奶粉的PBST(400 mL PBS+100μL Tween 20)封闭60 min，按抗体要求的比例加入兔抗小鼠一抗(1∶3 000)、β-actin兔抗小鼠一抗(l∶3 000)。4 ℃过夜，室温复性1 h，PBST洗膜4次，每次10 min，按一定比例(l∶10 000)加入相应的山羊抗小鼠二抗，室温避光孵育120 min。PBS洗去未结合的二抗5次，每次5 min。用Western blot红外荧光显像仪显影。
2 结 果
2.1 肉桂酸对小鼠游泳能力的影响 运动给药组最后一次给药后1 h，对运动训练组和运动给药组进行力竭游泳测试，结果表明进行运动训练的两组小鼠力竭游泳时间较安静对照组显着增加(P<0.01)，运动给药组小鼠游泳时间明显长于运动对照组(P<0.01)，见图1。
图1 3组小鼠力竭游泳时间
2.2 血浆中LAC的含量检测 结果显示，运动训练组小鼠血浆LAC较安静对照组显着升高(P<0.01)；而服用肉桂酸的运动给药组小鼠血浆LAC相对于安静对照组虽有所上升，但差异无统计学意义(P>0.05)，相对于运动训练组则呈现显着性降低(P<0.01)，见图2。
2.3 肝脏中SOD、MDA和CAT含量的检测 实验结果表明，力竭性游泳训练会导致肝脏中SOD的活性显着降低，运动训练组和安静对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；肉桂酸给药14 d，运动给药组与安静对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；运动给药组与运动训练组比较差异有统计学意义(P<0.01)。力竭性游泳训练后，肝脏中MDA的含量显着增加，运动训练组与安静对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；运动给药组与安静对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；注射肉桂酸的运动给药组与运动训练组比较，MDA含量显着降低，差异有统计学意义(P<0.01)。力竭游泳训练后，肝脏中CAT的含量表现为运动训练组与安静对照组比较显着降低(P<0.01)；服用肉桂酸的运动给药组与安静对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；运动给药组与运动训练组比较CAT的含量则显着性上升(P<0.01)，结果见表1。
图2 力竭性游泳后3组小鼠血浆LAC含量
表1 3组小鼠肝脏组织中SOD、MDA和CAT的含量比较
2.4 Western blot检测小鼠股四头肌中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶表达水平结果。
2.4.1 Western blot检测小鼠股四头肌 力竭性游泳后运动训练组和运动给药组与安静对照组比较均显着降低(P<0.05)，运动给药组的Na+/K+-ATP酶的表达水平显着高于运动训练组小鼠的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
*：P<0.05，**：P<0.01，与安静对照组比较；△：P<0.05，与运动训练组比较。1：安静对照组；2：运动给药组；3：运动训练组(n=3)。
图3 免疫印迹法检测小鼠肌肉中Na+/K+-ATP酶的表达
2.4.2 Western blot法检测小鼠股四头肌中Ca2+/Mg2+-ATP酶的表达 力竭性游泳后运动训练组和运动给药组与安静对照组比较均显着降低(P<0.01)；运动给药组小鼠的Ca2+/Mg2+-ATP酶的表达水平显着高于运动训练组小鼠的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。
**：P<0.01，与安静对照组比较；△：P<0.05，与运动训练组比较。1：安静对照组；2：运动给药组；3：运动训练组(n=3)。
图4 免疫印迹法检测小鼠肌肉中Ca2+/Mg2+-ATP酶的表达
3 讨 论
本次实验得出，肉桂酸显着提升了小鼠的运动耐力。运动员在长时间高强度运动训练中，肌肉为了满足能量需求会产生糖酵解，必然生成大量的乳酸，乳酸在体内堆积时可影响肌肉的收缩功能和运动能力，刺激神经末梢，从而引起肌肉的痉挛、疼痛和局部水肿等一系列表现，严重影响训练效果和运动成绩，因此，减少乳酸在肌肉中的堆积，可以延缓疲劳的发生或加速疲劳的消除[10]，提高运动效率。本研究结果表明，运动训练组小鼠血浆乳酸含量显着增加(P<0.01)，这与运动员训练后的机体反应是相符的，而给予肉桂酸的小鼠其血浆中的乳酸含量大大减少，可能是在进入机体后通过降低机体的乳酸含量，从而改善运动者的组织代谢，减轻身体内乳酸的堆积，进而降低乳酸对肌肉和神经末梢的影响，使运动给药组的小鼠力竭游泳持续的时间更久，运动耐力更强。
力竭游泳还导致了小鼠体内ROS的大量产生，过量的氧自由基导致体内氧化与抗氧化功能失衡，由于力竭运动导致的体内高度氧化损伤使运动耐力显着下降，更易导致疲劳的产生，肝脏中MDA水平反映了氧自由基对细胞膜不饱和脂肪酸的破坏程度，而肝脏里存在的大量的抗氧化酶如SOD和CAT，其含量则直接反映了身体应对由运动引起的氧化应激的保护能力，SOD可以清除细胞内的氧自由基和超氧阴离子自由基，抑制氧自由基带来的细胞损伤[11]，CAT可以直接水解由于富集的ROS所产生的H2O2，进一步起到抗氧化的作用[12]。本实验中，在力竭运动后，运动训练组的小鼠MDA显着升高，细胞膜稳定性下降，更易疲劳，而给予肉桂酸的运动给药组小鼠MDA水平与运动训练组相比则明显下降；其SOD和CAT水平与安静对照组相比SOD虽然显着下降但是远比不给肉桂酸的运动训练组高，而CAT的含量已经接近正常水平，明显高于运动训练组小鼠，这些可能与肉桂酸促进了小鼠SOD和CAT的合成，促进了CAT的稳定性，从而使体内自由基能及时得到清除有关，MDA的降低也提示了ROS对细胞膜的毒性得到抑制，从而对小鼠具有抗疲劳的效果，力竭游泳的时间也更持久，运动耐力得到增强。
ATP酶是生物膜上的一种重要的活性蛋白酶，其在物质转运、能量转换和信息传递方面具有重要的作用[13]。当剧烈运动引起氧化应激时，膜的完整性和流动性都受到了破坏，受损的生物膜使ATP酶的活性降低，从而使神经信号的传导以及骨骼肌的收缩受到影响，更易引起痉挛和运动疲劳的产生[14]。本实验证实了剧烈运动引起的氧化应激会导致生物膜的损伤，从而使ATP酶的含量降低，给予肉桂酸的运动给药组小鼠生物膜完整性和流动性得到保护，神经信号传导更好，对肌肉的调控更灵敏，同时线粒体供能更强，骨骼肌的抗疲劳能力更显着，运动耐力得到提升。
肉桂酸在运动保健方面的功能有望为运动员和运动爱好者提高运动表现发挥作用，本实验结果对防止运动损伤、提高运动能力的临床治疗及运动保健补剂的开发均提供了重要的实验依据。
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Experiment research of cinnamic acid on endurance exercise in mice
MuXu1,LiJin2
(1.DepartmentFoundation,ShougangInstituteofTechnology，Beijing100041，China；2.SportsSection,BeijingUniversityofCivilEngineeringandArchitecture，Beijing100044，China)
Objective To investigate the effects of cinnamic acid to enhance the exercise endurance in mice.MethodsThrough the exhaustive swimming to establish mice exhaustive exercise model,the mice were divided into control group,exercise control group and exercise cinnamic group(n=10),the mice exhaustive swimming time were comparted,blood lactic acid(LAC) levels were used to explore the endurance of cinnamic acid in mice;the super oxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA) and peroxidase (CAT) content in liver homogenates were used to detect mice endurance enhancement and antioxidant capacity of cinnamic acid,and expression of Na+/K+-ATP enzyme,Ca2+/Mg2+-ATP enzyme on mice quadriceps by Western blot to further study its effect on improving exercise capacity in mice.ResultsCinnamic acid significantly prolonged the swimming time of mice;Exercise cinnamic group compared with control group:although the LAC content in plasma elevated,the difference was not statistically significant(P>0.05),SOD and CAT in liver homogenate was significantly decreased(P<0.05),MDA increased significantly(P<0.01),CAT was decreased but with no statistically significant(P>0.05),the expression level of Na+/K+-ATP enzyme and Ca2+/Mg2+-ATP enzyme decreased significantly(P<0.01).Exercise control group compared with control group:the LAC content in plasma increased significantly(P<0.01),SOD and CAT in liver homogenate was significantly decreased(P<0.01),MDA increased significantly(P<0.01),expression level of Na+/K+-ATP enzyme and Ca2+/enzyme Mg2+-ATP decreased significantly(P<0.01);Exercise cinnamic group exercise control group:the LAC content in plasma was significantly reduced(P<0.01),SOD and CAT in liver tissue significantly increased(P<0.01),MDA decreased significantly(P<0.01),CAT decreased significantly(P<0.01),the expression level of Na+/K+-ATP enzyme and Ca2+/Mg2+-ATP enzyme decreased significantly(P<0.05).ConclusionCinnamic acid has good oxidation resistances and anti-fatigue ability.
cinnamic acid;endurance exercise;antioxidant
10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.011
穆旭(1979-)，副教授，硕士,主要从事运动营养康复和体育教育理论研究。
R872.7
A
1671-8348(2015)35-4932-04
2015-05-15
2015-07-21)
