于黎明，陈 姝，何 松△
(重庆医科大学附属第二医院:1.消化内科;2.血液科 400010)
·技术与方法·
具有双向分化潜能的鼠胎肝干细胞的分离、培养及鉴定*
于黎明1，陈姝2，何松1△
(重庆医科大学附属第二医院:1.消化内科;2.血液科400010)
目的优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞(LSC)的方法，并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞(FLSC)，以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定FLSC的增殖，通过添加二甲基亚砜(DMSO)和HGF等诱导干细胞分化。结果分离后的FLSC 24 h内贴壁，卵圆形，排列紧密，1～2周内活化， CD133、CD49f、EPCAM的阳性率分别为(97.95±1.21)%、 (92.71±3.49)%、和(50.73±3.45)%，表达甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)；诱导分化后糖原染色(PAS)法染色可见红色糖原颗粒，表达清蛋白(ALB)、肝细胞核因子4α(HNF-4α)。结论联合密度梯度离心和差异性贴壁法成功分离FLSC，分离后的FLSC干性强，增殖能力强，具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。
胚胎肝干细胞;离心法,梯密度;细胞,培养的;细胞分化
ofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)
肝脏干细胞(liver stem cell,LSC)是具有自我增殖和多向分化潜能的细胞，在适当条件下可以向肝细胞、胆管上皮细胞、胰腺细胞[1]、神经细胞等细胞进行分化。目前LSC的来源主要有成体肝脏和胎肝。由于成体肝脏中干细胞数量极少，占肝脏中总细胞数约为0.5%～1.5%[2-3]，通过DDC(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-collidine)处理构建肝损伤模型[4]可提高LSC含量;有报道[5]指出孕8.5～14.5 d胎肝中LSC的含量可达2%～5%，且细胞的活性高，便于实验的开展。本实验旨在采用简化的密度梯度离心法联合细胞差异性贴壁法[6]筛选并培养胎肝干细胞(fetal liver stem cells,FLSC)，并验证其具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能。
1 材料与方法
1.1实验动物SPF级C57BL/6孕鼠,孕期13.5 d，体质量40～50 g,由重庆医科大学实验中心提供，实验过程对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.2主要试剂与仪器胰岛素(insulin)、白血病分化抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、Ⅳ型胶原酶购自美国Sigma公司；Percoll分离液购自美国Pharmacia公司；表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)购自美国Peprotech公司；清蛋白(ALB)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子4α(HNF-4а)兔抗鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司； PCR逆转录试剂盒、TRIzol购自Takara公司。流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像仪购自Bio-Rad公司。
1.3FLSC的分离麻醉(4%水合氯醛，10 mL/kg)孕期13.5 d的C57BL/6小鼠，无菌取出胎肝，剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.1%Ⅳ胶原酶及DNaseⅠ，37 ℃水浴消化30 min,吹打混匀后将细胞悬液依次经75、150 μm过滤器过滤。收集滤液，1 500 r/min离心5 min,弃上清，重悬沉淀至2～3 mL。配制70%、50%、30%的percoll密度梯度离心液，重悬的细胞沉淀铺于梯度离心液上方。常温下,400×g离心25 min,吸取30%～50%间的细胞条带;常温下300×g离心10 min,收集沉淀，加入含有10%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L L-谷氨酰胺、20 μg/L EGF、10 μg/L LIF、10 mg/L胰岛素、1×10-7mol/L地塞米松、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM/F-12培养基重悬。台盼蓝染色计算细胞的总数和存活率。
1.4小鼠FLSC的纯化与培养以1×106个/皿密度接种至鼠尾胶原包被(浓度[6]为1×6-10μg/cm2)的60 mm培养皿中。置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，24 h后换液。待细胞融合约80%～90%时加入Tryple Express,37 ℃消化2.5 min,此时体积较大的肝细胞、星形细胞和成纤维细胞会消化下来，而体积较小的FLSC则大部分贴壁。运用此种方法纯化细胞2～3次，可以得到纯度较高的FLSC。
1.5FLSC的鉴定
1.5.1流式细胞术消化细胞，收集1×106细胞悬液，离心后含1%牛血清清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞至100 μL，封闭30 min,加入CD133、EPCAM、CD49f抗体及同型对照，4 ℃避光孵育30 min,离心，PBS重悬至100 μL，流式细胞仪检测。
1.5.2细胞免疫荧光接种FLSC至10 μg/cm2鼠尾胶原预先包被的铺有爬片的24孔板中，37 ℃、5% CO2孵箱中培养3～5 d，待细胞融合约30%～50%，取出爬片，预冷PBS冲洗5 min×3次,加入4%多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗5 min×3次,6%大鼠血清室温固定30 min，加入抗体CD133、EPCAM、CD49f,4 ℃避光孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次，二脒基苯基吲哚(DAPI)染核5 min，避光条件下PBS冲洗5 min×3次，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。
1.6FLSC的增殖
1.6.1FLSC克隆形成消化FLSC，以1 000个/孔密度接种至胶原包被的6孔板中，添加含有20 μg/L EGF、10 μg/L LIF的DMEM/F-12培养基，37 ℃、5% CO2孵箱中培养3～4周，观察细胞克隆形成的时间、体积及克隆中细胞的数目。
1.6.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测干细胞增殖收集对数生长期的FLSC，调整细胞浓度至每毫升4×104个， 每孔100 μL接种于96孔板(4 000个/孔)，每组设6个复孔， 置于37 ℃、5% CO2培养箱中。分别于接种后1、2、3、4、5 d加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃、5% CO2孵箱中继续陪养4 h。吸取孔内培养基，加入150 μL DMSO，摇床上避光低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪测量各孔490 nm处的吸光度值[A490]。
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1.7检测FLSC分化潜能
1.7.1合成糖原功能检测 除去LIF同时添加1% DMSO、10 μg/L HGF合成分化培养基，接种FLSC，连续培养2周，观察细胞形态变化，按照试剂盒说明书进行糖原染色(PAS)[6-7]，正置显微镜下观察细胞质中的糖原颗粒。
1.7.2细胞免疫荧光分别接种FLSC至普通培养基和分化培养基，37 ℃、5% CO2孵箱中培养2～3周，预冷PBS冲洗5 min×3次,加入4%多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗5 min×3次,常温下0.1%Triton-100 透化细胞10 min;6%山羊血清室温固定30 min,分别加入抗体ALB(1∶50)、HNF-4α(1∶50)，置于湿盒中,4 ℃孵育过夜，PBS冲洗5 min×3次，加入四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗兔二抗(1∶50)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗(1∶50)，避光37 ℃孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次；DAPI染核5 min，避光条件下PBS冲洗5 min×3次，抗荧光淬灭剂封片正置荧光显微镜下观察。
1.7.3RT-PCR检测收集普通和分化条件下培养2周的FLSC，加入TRIzol，提取总RNA,按照试剂盒说明书反转录为cDNA。用Prime5.0软件设计目的基因AFP、ALB、HNF-4α及内参GAPDH的PCR引物序列，委托上海英俊公司进行引物的合成。引物序列见表1。反应条件:95 ℃10 min；95 ℃30 s，54～58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环；最后72 ℃10 min；3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪显影。
1.8检测FLSC胆管上皮细胞分化潜能培养基中除去LIF，同时接种FLSC至细胞外基质上，观察细胞形态学差异性，同时应用细胞免疫荧光技术及RT-PCR检测胆管细胞标记物CK19的表达。
2 结 果
2.2FLSC鉴定
2.2.1细胞免疫荧光检测干细胞表面标记物的表达结果显示卵圆形、多边形FLSC中EPCAM、CD133阳性表达(图2A)；而集落样排列的FLSC中，CD49f高表达，EPCAM表达相对较弱(图2B)。
2.2.2流式细胞术检测FLSC中CD133、CD49f、EPCAM阳性率分别为(97.95±1.21)%、(92.71±3.49)%、(50.73±3.45)%(n=3)。
2.3FLSC增殖
2.3.1FLSC平板克隆实验结果实验发现接种细胞密度较低时细胞增殖能力受到抑制，提高接种密度后细胞增殖能力明显增强。FLSC接种后连续培养2周开始出现小的细胞克隆，继续培养至4周可见细胞克隆体积增大，克隆中细胞数目明显增加。
表1 引物序列和退火条件
A：FLSC原代培养2周；B：FLSC原代培养3周；C：第二代培养2周。
图1FLSC原代培养相差显微图(×100)
图2 细胞免疫荧光鉴定FLSC中EPCAM、CD133、CD49f的表达(×100)
2.3.2细胞增殖曲线结果显示FLSC接种后1～2 d内增殖缓慢，3 d后，A490值增加明显，FLSC表现出强大的增殖能力(图3)。
图3 FLSC增殖曲线
2.4FLSC具有双向分化潜能
2.4.1PAS结果FLSC在分化培养基中连续培养2～3周，部分细胞体积增大，脱离细胞集落且出现双细胞核，PAS结果显示，细胞质中可见红色的糖原颗粒(图4A)。FLSC接种至细胞外基质中，可见细胞集落伸出树枝状结构(图4B)。
2.4.2细胞免疫荧光检测FLSC 中CK19、ALB、HNF-4α的表达结果显示FLSC表达ALB，低表达或不表达HNF-4α，在分化培养条件下细胞出现双核结构，且成熟肝细胞标记物ALB和HNF-4α表达明显增加；在细胞外基质中培养，细胞出现导管状结构，同时高表达胆管细胞标记物CK19(图4C)。
A、B：PAS;C:免疫荧光图(×200)；D：RT-PCR凝胶分离图。
图4FLSC具有双向分化潜能
2.4.3RT-PCR检测FLSC分化前后AFP、ALB、CK19、HNF-4α结果与细胞免疫荧光较为一致，分化条件下连续培养2～3周，AFP、CK19表达降低，ALB、HNF-4α表达增强。
3 讨 论
LSC是一种具有自我增殖和多向分化潜能的细胞，有研究指出LSC起源于肝脏组织，而不是来源于肝脏外的造血干细胞或骨髓干细胞[8]，同时LSC与肝细胞癌、肝脏的损伤后修复有重要关系。普遍认为在正常情况下，LSC处于静息状态，当肝脏急性损伤后肝内的LSC会爆发性增殖，但肝脏慢性损伤时，LSC则不会增殖[8]。由于成体肝脏中FLSc的含量稀少，且细胞多处于静息状态，虽然有研究采用DDC饮食构建急性肝损伤模型[4]，促进LSC的增殖，但是成体肝脏中含有实质细胞和非实质细胞[9]，细胞种类较多，普通方法难以分离，目前多采用细胞流式分选法联合或不联合免疫磁珠分选法[2]，虽然明显提高了LSC的含量与纯度，但是由于LSC没有特异性的标记物，分选时通常需要联合多种表面标记物，如EPCAM[9-10]、CD133[2]、CD49f等阳性分选，CD31、CD45、CD11b等阴性分选，造价较高，同时细胞流式分选术和免疫磁珠分选术对实验条件、技术、设备等要求较高，限制了成体肝脏LSC的分离及应用。有报道[5]指出胎肝中LSC含量较丰富，远高于成体肝脏中LSC的含量，同时胎肝中干细胞的活性更高，便于干细胞的分离、培养和后续试验的开展。Liu等[5]在实验中发现通过构建30%、50%、70%不同密度的percoll液经非连续密度梯度离心后，大鼠FLSC主要集中在30%～50%的percoll液层面中，而早期在(choline-deficient ethionine，CDE)饲喂构建小鼠肝脏损伤模型中发现，肝脏卵圆细胞则主要集中于20% percoll液层面[11]。但是针对小鼠FLSC的研究则不多。
本研究中采用非连续密度梯度离心分离孕期13.5 d的小鼠胎肝，发现FLSC主要集中于30%～50%的percoll液层面中，与早前大鼠中的结果相一致[5]，通过联合后期细胞差异性消化法，成功分离出FLSC。经流式细胞术联合细胞免疫荧光技术检测，验证了筛选的FLSC高表达CD133、CD49f、EPCAM等目前常用的干细胞表面标记物；同时通过细胞克隆增殖实验发现细胞接种后1～2周内开始活化，之后表现出强大的增殖能力；在HGF及DMSO促肝细胞分化条件下，连续培养2～3周后，PAS实验、细胞免疫荧光、RT-PCR等实验结果表明细胞向肝细胞方向进行分化，这与之前的研究相一致[4-5]。将细胞接种于细胞外基质上，连续培养后发现细胞周边出现胆管上皮细胞特异性的树枝状结构和高表达CK19的导管状细胞结构，早前的研究认为CK19主要表达于胆管区域，同时也表达于许多LSC[3]，可以作为胆管上皮细胞和LSC共同的标记物。
本实验成功分离出纯度较高的FLSC，方法较为简单，便于后续实验的开展。肝脏LSC对肝细胞癌及急性肝损伤后的治疗有重要的意义，有文献[12]报道肝脏LSC与肿瘤LSC有一定的关系，在适当条件下可以转化为肿瘤LSC，进而引发肝癌，但二者之间发生转化的具体机制仍未明了，同时肝脏LSC向肝细胞、胆管上皮细胞、软骨细胞、胰岛细胞等进行分化的具体机制还不清楚，研究这些问题将对未来肝细胞癌的治疗产生重要的意义。
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Isolation,culture and identification of bi-directional differentiation potential liver stem cells in fetal mice*
YuLiming1,ChenShu2,HeSong1△
(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofHematology,SecondAffiliatedHospital
ObjectiveTo optimize the method of isolating,culturing and screening fetal mouse liver stem cells in vitro,and to identify the potential of bi-directional differentiation.MethodsThe fetal liver stem cells of mouse were isolated by the density gradient centrifugation and cell difference adherence method,the proliferation of stem cells was determined by cell plate cloning technique and MTT method;stem cells were induced for differentiation by adding DMSO and HGF.ResultsThe isolated stem cells showed adherence within 24 h,which were orbicular-ovate,closely packed,activated within 1～2 weeks;the positive rates of CD133,CD49f and EPCAM were (97.95±1.21)%,(92.71±3.49)% and (50.73±3.45)% respectively;AFP and CK19 proteins were expressed;red glycogen granules were seen by PAS after induced differentiation;ALB and HNF-4α were expressed.ConclusionFetal hepatic stem cells are successfully isolated by the density gradient centrifugation combined with difference adherence method,and the isolated cells have strong stemness and proliferation ability,as well as the ability of bi-directional differentiation towards hepatocytes and bile duct epithelial cells.
fetal liver stem cells;centrifugation,density gradient;cells,cultured;cell differentiation
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.026
重庆市卫生局医学科研计划重点项目(2013-1-019)。作者简介:于黎明(1986-)，住院医师，在读硕士,主要从事消化内科研究。△
，E-mail： hedoctor65@sina.com。
R329
A
1671-8348(2016)12-1666-04
2015-12-08
2016-01-12)
