芹菜素对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响

李　英，朴虎雄，玄云泽

(延边大学附属医院口腔科，吉林延吉 133000)



·经验交流·

芹菜素对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响

李英，朴虎雄，玄云泽△

(延边大学附属医院口腔科，吉林延吉 133000)

目的探讨芹菜素对体外培养的人舌癌Tca8113细胞增殖及凋亡的作用。方法不同浓度(20、40、80、160 μmol/L)芹菜素处理舌癌Tca8113细胞，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的抑制作用；Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞的凋亡率；逆转录PCR(RT-PCR)法检测B淋巴细胞癌-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达变化。结果芹菜素各组细胞增殖均有不同程度的抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。芹菜素对Tca8113细胞增殖的抑制效果呈一定程度的时间依赖性和剂量依赖性，随着浓度提高和作用时间延长，抑制效果更明显(P<0.05)。对照组及不同浓度芹菜素组(除20 μmol/L)组间两两比较，药物浓度越高，细胞凋亡率越显着(P<0.05)。除20 μmol/L外芹菜素各浓度组组人舌鳞癌细胞连续培养48 h后,Bcl-2 mRNA的表达水平随着浓度降低，而Bax mRNA表达水平增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论芹菜素对人舌癌Tca8113细胞的增殖具有抑制作用，并诱导细胞的凋亡，其机制可能与抑制Bcl-2 mRNA表达、促进Bax mRNA表达有关。

芹菜素；癌，鳞状细胞；舌肿瘤；细胞凋亡；细胞增殖；基因，bcl-2；bax

芹菜素是一种天然黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等药理作用，尤其抗肿瘤作用较明显[1-3]。国内外众多学者对芹菜素的抗肿瘤作用及其机制做了大量研究，然而有关舌鳞癌方面研究报道较少。本研究检测芹菜素对舌鳞癌细胞株Tca8113细胞增殖及凋亡的影响，对凋亡机制进行了初步探讨，为人舌癌的预防及治疗提供理论依据和实验基础。

1　材料与方法

1.1材料芹菜素购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基购自北京Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑盐(MTT)、50×Tae电泳缓冲液购自北京Solarbio公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国AMRESCO公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂购自上海bestbio公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)购自北京NobleRyder公司；琼脂糖购自西班牙biowest Agarose公司；Trizol总RNA抽提试剂盒购自北京ihvitrogen公司；一步法逆转录PCR(RT-PCR)Kit试剂盒、Maker购自日本TaKaRa公司；溴化乙锭(EB)购自北京sybr green公司；内参照β-actin引物、B淋巴细胞癌-2(Bcl-2)引物、Bcl-2相关X蛋白(Bax)引物，购自上海生工生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞株及细胞培养舌癌Tca8113细胞株由延边大学病理教研室提供；培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5%CO2电恒温培养箱内常规传代培养，装入己灭菌的冻存管中，按4 ℃ 30 min，-20 ℃ 15 min，-80 ℃ 60 min，-196 ℃的顺序逐步降温，液氮冻存，备用。

1.2.2MTT法检测细胞增殖的影响Tca8113细胞用胰蛋白酶消化，吹打细胞成单细胞悬液，稀释至5×104个/mL；接种于96孔培养板中，将培养板置入37 ℃含CO2恒温箱中培养24 h，待细胞贴壁后，吸弃孔内上培养液，加入20、40、80、160 μmol/L浓度的芹菜素溶液，设为不同浓度芹菜素组，仅加等量不含芹菜素的培养液设对照组，每组6个重复孔；继续在CO2恒温箱中分别培养24、48、72 h，每孔加20 μL MTT，放置在5%CO2、37 ℃及饱和湿度条件下继续CO2培养箱培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，在避光状态下振荡10 min，酶标仪上设定490 nm波长,检测每孔细胞的吸光度(OD)值，每天测量1组，连续3 d。以上操作重复3次。各浓度芹菜素组按下列公式计算：细胞生长抑制率=(1-不同浓度芹菜素组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色法应用流式细胞仪检测细胞凋亡率与MTT法相似，以细胞密度(5×104个/mL)接种于培养瓶中，每瓶约l×106个细胞，加入适量培养液培养贴壁后弃去培养液，更换等量浓度分别为20、40、80、160 μmol/L芹菜素的RPMI-1640培养基培养48 h，对照组加入等量RPMI-1640；离心收集悬浮细胞，弃去培养基，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，加入400 μL的1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×106个/mL；将5 μL Annexin V-FITC加入细胞悬浮液中混匀，于2～8 ℃避光条件下孵育，加入10 μL碘化丙啶(PI)轻轻混匀，于2～8 ℃避光条件下孵育5 min，在1 h内用流式细胞仪检测。机械损伤细胞(Annexin V FITC-/PI+)；正常的活细胞不被Annexin V-FITC和PI染色(Annexin V FITC-/PI-)；早期的凋亡细胞仅Annexin V-FITC染色，PI染色呈阴性(Annexin V FITC+/PI-)；坏死细胞和凋亡晚期细胞可以同时被Annexin V-FITC和PI染色(Annexin V FITC+/PI+)，则早、晚期凋亡细胞及坏死细胞均计为凋亡细胞。

1.2.4RT-PCR 检测法Bcl-2、Bax的mRNA表达同上1.2.2细胞培养，加入不同浓度芹菜素培养48 h,1.0 mL Trizol加到细胞表面，室温下裂解细胞；冰上静置并加入氯仿后盖紧EP管管盖，振荡混匀，待溶液呈乳白状而无分相现象后冰上静置3 min，离心15 min；取出匀浆液，将上层无色的上清液转移至另一干净EP管中，加入异丙醇并充分混匀，冰上静置，离心10 min；弃去上清液，RNA沉于管底，沿EP管壁加入75%冰乙醇，离心5 min；RNA沉淀于室温晾干，当RNA 沉淀变透明后用30 μL去RNA酶的纯水溶解RNA，温浴10 min；待沉淀完全溶解后，置于-80 ℃冰箱保存；核蛋白仪测量RNA浓度和纯度鉴定，制备的琼脂糖凝胶板放入电泳槽中，倒入1×TAE电泳缓冲液，取5 μL总RNA加样，1.0%琼脂糖凝胶上电泳30 min，电泳胶移至紫外灯下观察RNA是否降解来鉴定RNA完整性。β-actin引物扩增片段长度为350 bp做内参照，Bcl-2扩增片段长度为195 bp，Bax扩增片段长度为276 bp；在Microtube管中配制混合液，离心使模版RNA混合液聚集于管底部，混合物置于PCR仪上进行变性、退火反应；冰浴条件下，在PCR仪上进行反转录反应；拍打PCR管，混匀，在PCR仪进行扩增；琼脂糖凝胶的制备后入电泳槽中进行电泳40～60 min后，胶块置于紫外凝胶图像分析仪下观察，扫描。成像分析ImageJ软件测定各条带的光密度值,每组试验做3个平行重复，以3次重复的平均值为依据，计算样品中目的基因β-actin扩增条带的光密度值比值。

2　结　果

2.1MTT法检测芹菜素对Tca8113细胞增殖的抑制效果芹菜素各组细胞增殖均有不同程度的抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。芹菜素对Tca8113细胞增殖的抑制效果呈一定程度的时间依赖性和剂量依赖性，随着浓度提高和作用时间延长，抑制效果更明显(P<0.05)，见表1。

表1　芹菜素不同浓度、不同时间对Tca 8113细胞抑制率(%)

a:P<0.05，与24 h比较；b:P<0.05，与对照组比较。

2.2流式细胞术检测芹菜素作用于Tca8113细胞48 h凋亡率试验结果表明，除了20 μmol/L外,随着药物浓度提高，芹菜素对Tca8113细胞早期、晚期及总凋亡率均有上升趋势。对照组及不同浓度芹菜素组两两比较表明，随着药物浓度提高，细胞凋亡率更为显着(P<0.05)，见表2、图1。

表2　芹菜素作用48 h后不同浓度对Tea8113细胞凋亡

a:P<0.05，与对照组比较。

2.3PCR-RT检测芹菜素作用48 h时Tca8113细胞Bcl-2、Bax的mRNA表达变化除20 μmol/L外，芹菜素各浓度组组人舌鳞癌细胞连续培养48 h后,Bcl-2 mRNA的表达水平随着浓度降低，而Bax mRNA表达水平增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图2。

表3　不同浓度Bcl-2、Bax mRNA光密度值分析

a:P<0.05，与对照组比较。

A：对照组；B：芹菜素20 μmol/L组，48 h；C：芹菜素40 μmol/L组，48 h；D：芹菜素80 μmol/L组，48 h；芹菜素160 μmol/L组，48 h。

图1流式细胞仪检测结果

A：48 h后Tca8113细胞Bcl-2 mRNA的表达；B：48 h后Tca8113细胞Bax mRNA的表达；C：48 h后Tca8113细胞β-actinm RNA的表达。

图2PCR-RT检测结果

3　讨　论

芹菜素作为一种植物源性抗肿瘤药物，且具有毒副作用小的优点，成为有开发前景的天然肿瘤药物，是肿瘤研究界的新焦点[3-5]。Choi等[6]研究发现，在浓度为20～160 μmol/L芹菜素分别作用在乳腺癌MDA-MB-453细胞24、48、72 h，芹菜素对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖的抑制作用有明显的剂量和时间依赖性。蔡婧等[7]研究发现不同浓度的芹菜素作用下培养肝癌Huh-7细胞，其抑制率差异有统计学意义。本研究采用MTT法检测芹菜素对人舌癌Tca8113细胞增殖的抑制情况，试验结果显示，相同药物浓度下不同时间、相同时间下不同浓度芹菜素组与对照组间差异有统计学意义，而且芹菜素对舌癌Tca8113细胞的增殖的抑制作用呈的一定的时间、剂量依赖性，与乳腺癌、肝癌方面研究报道一致[6-7]。

细胞凋亡是指细胞在一定生理或病理条件下出现的程序主动性、生理性死亡过程，Annexin V-FITC与PI双标记结合流式细胞术是检测体外细胞凋亡的比较常用的方法。但其缺点是晚期凋亡细胞与坏死细胞之间区分较为困难，若研究凋亡或是坏死本身通路等方面，需进行进一步相关研究。本研究虽然将晚期凋亡细胞及坏死细胞均统一计为晚期凋亡细胞来进行计算，但仅早期凋亡与对照组相比具有统计学意义，不同浓度芹菜素组总凋亡率也明显高于对照组。Moghaddam等[8]、李明勇等[9]检测芹菜素作用于人胃癌BGC823 细胞、人鼻咽癌CNE-2Z细胞，证实随着浓度增加，细胞的凋亡率有上升趋势。本试验结果表明不同浓度芹菜素对Tca8113细胞作用48 h，除20 μmol/L外其他组芹菜素浓度依赖性地诱导凋亡，与文献报道一致。

细胞凋亡过程中多种基因将会被激活、表达及调控,从中出现抗凋亡基因和促凋亡基因两大类相关的基因，而在此过程中Bcl-2、Bax基因备受关注。Bcl-2是目前最受重视的调控凋亡细胞的基因，也是与凋亡有关的基因主要调节者。Bax基因的作用与Bcl-2基因相反，是促凋亡基因，它的过表达可使拮抗Bcl-2的促进细胞增殖及抑制凋亡的作用。编码的Bax蛋白可自身形成同源二聚体诱导凋亡，而且将与Bcl-2蛋白及Bcl-x1蛋白形成异源二聚体，导致加速细胞凋亡发生[10-11]。研究发现，芹菜素作用于肺癌A549细胞、人胃癌细胞，上调细胞Bax的表达、下调Bcl-2 表达，且呈剂量依赖性[12-13]。李卫林等[14]结果表明，人前列腺癌PC-3细胞裸鼠移植瘤中芹菜素中、高剂量组能促进Bax的表达、抑制Bcl-2的表达。本试验通过RT-PCR检测，人舌鳞癌细胞连续培养48 h后，除20 μmol/L外其他浓度芹菜素组与对照组相比，Bcl-2、Bax mRNA的表达水平均差异有统计学意义，这表示降低Bcl-2 mRNA表达、上调Bax mRNA表达是芹菜素在一定浓度下诱导Tca8113细胞发生凋亡的机制之一。

综上所述，芹菜素作为一种植物提取物的活性成分，能够有效抑制舌鳞癌Tca8113细胞增殖，诱导细胞凋亡，提示芹菜素对舌鳞癌有一定防治作用，且对芹菜素的进一步研究打下基础。

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李英(1987-)，住院医师，硕士，主要从事口腔颌面外科肿瘤研究。△

,Tel:13943322882；E-mail:xuanyunze@sina.con。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.035

R780.2

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1671-8348(2016)13-1828-04

2015-11-23

2016-01-26)