郑晓珂，王利娟，张红巧，杨小昂
(1.郑州大学第五附属医院肿瘤科，郑州 450052；2.郑州大学医药科学研究院，郑州 450052)
·论着·
甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡的诱导作用*
郑晓珂1，王利娟1，张红巧1，杨小昂2
(1.郑州大学第五附属医院肿瘤科，郑州 450052；2.郑州大学医药科学研究院，郑州 450052)
目的探讨甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡诱导作用及相关机制。方法以甘草酸苷(0、10、30、100 μg/mL)处理肝癌细胞SMCC-7721 48 h后，咪唑蓝(MTT)法检测肝癌细胞活力的影响；流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位；紫外分光光度法检测细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspase-9活性的影响；Western blot分析线粒体途径中相关蛋白p53、细胞色素C(CytC)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关蛋白(Bax)的表达。结果与阴性对照比较，10、30、100 μg/mL甘草酸苷可显着降低细胞的活力(P<0.01)，诱导细胞凋亡(P<0.01)，促进线粒体膜电位去极化(P<0.01)，抑制肝癌细胞SMCC-7721Caspase-3、Caspase-9活性(P<0.01)，并上调p53、CytC、Bax的表达(P<0.01)，下调Bcl-2的表达(P<0.01)，且作用呈现浓度依赖关系。结论甘草酸苷可通过线粒体途径诱导肝癌细胞SMCC-7721凋亡。
肝肿瘤；细胞凋亡；甘草酸；肝癌细胞SMCC-7721；甘草酸苷；线粒体途径
肝癌是世界上最常见的癌症之一，目前临床上使用的化疗药物在杀死癌细胞的同时，也杀死了正常的细胞，给患者造成了很大痛苦，寻找高效、低毒的药物具有显着意义。病毒引起的肝硬化、肝炎是肝癌产生的危险因素[1-2]。在治疗慢性病毒性乙型肝炎的临床研究中发现，复方甘草酸苷有降低肝细胞损害的作用[3]。亦有研究表明甘草酸苷对急性肝衰竭大鼠模型具有保护作用[4]。本课题考察甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721的凋亡诱导作用及其机制，现报道如下。
1 材料与方法
1.1材料人肝癌细胞SMCC-7721购于中国科学院上海细胞库，目录号为TCHu 52。 复方甘草酸苷注射液，由日本米诺发源制药株氏会社提供，含甘草酸苷2 mg/mL，注册号为H20030185。兔抗p53、细胞色素C(CytC)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体购自美国Abcam公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、9分光光度法检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清、DMEM培养基、MTT购自美国Gibco公司。Forma Class Ⅱ生化培养箱购自美国Themo公司；ChemiDoc MP凝胶成像系统购自Bio-Rad公司； FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；双垂直电泳仪、转印电泳仪购自北京六一仪器厂；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪购自瑞士TECAN集团公司。
1.2方法
1.2.1MTT法将处于对数生长期的肝癌细胞SMCC-7721，消化，调整细胞浓度，接种，培养24 h。加入含甘草酸苷(10、30、100 μg/mL)DMEM培养基，继续培养48 h，加MTT(5 mg/mL)20 μL，4 h后，吸弃上清液，并加入DMSO 150 μL，振荡摇匀，在酶标仪570 nm处测定光密度(OD)值。
1.2.2流式细胞术检测按1.2.1方法接种，给药48 h后，按照Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书的方法进行操作。用0.25%的胰蛋白酶[不含乙二胺四乙酸(EDTA)]消化细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，离心收集细胞；再按顺序依次加入500 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC及 5 μL碘化丙啶(PI)，混匀后，室温、避光反应10 min左右，在1 h内进行流式细胞仪检测。
1.2.3细胞线粒体膜电位(△ψm)检测按1.2.1方法接种，给药48 h后，按照JC-1法说明书的方法进行操作。用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化，PBS洗涤2次，离心收集细胞。将10×Incubation Buffer稀释成1×Incubation Buffer。取1 μL JC-1加入到500 μL 1×Incubation Buffer中配成JC-1工作液，取500 μL JC-1工作液，加入培养板中，37 °C孵育15 min，离心收集细胞，1×Incubation Buffer 500 μL重新悬浮细胞，流式细胞仪分析。线粒体膜电位检测采用荧光燃料JC-1作为跨膜电位指示剂。JC-1可透过正常细胞膜以单聚体形式聚集细胞内，并依赖于线粒体跨膜电位的极性，当其浓度增高可形成多聚体，并发射红色荧光 (Q2区间)；而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位去极化，细胞内JC-1浓度降低，就以单体的形式存在，发射绿色荧光(Q4区间)。根据这一特征检测线粒体膜电位的变化。
1.2.4Caspase-3、Caspase-9酶活性检测按1.2.1方法接种，给药48 h后，按照Caspase-3、Caspase-9分光光度检测试剂盒说明书的方法进行操作。用0.25%胰蛋白酶(不含 EDTA)消化，PBS洗涤2次，离心收集细胞。将50 μL 预冷的Lysis Buffer加入细胞中，吹打均匀并置冰上裂解30 min，每隔10 s进行振荡，4 ℃ 10 000 r/min离心 1 min，小心吸取上清液，置4 ℃待测。取1～2 μL上清液，检测其中的蛋白浓度。再吸取50 μL含100～200 μg 蛋白的细胞裂解上清液，按顺序依次加入2×Reaction Buffer 50 μL、Caspase-3 Substrate 5 μL，于37 ℃避光孵育4 h，用酶标仪检测405 nm处吸光度，计算出每毫克蛋白相当的OD值。
1.2.5Western blot检测按1.2.1方法接种，收集细胞，用裂解液裂解细胞，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，获得蛋白样品。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性，30～50 ng蛋白样品上样，进行十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶电泳2 h，湿法转膜30～60 min，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗(1∶100)4 °C孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(TBST)洗涤3次，后加入二抗(1∶500)室温孵育1.0～1.5 h，TBST洗涤3次。后加电化学发光(ECL)曝光液在凝胶成像系统中曝光。并用“Quantity one”软件对蛋白灰度值进行统计分析。
2 结 果
2.1甘草酸苷对肝癌细胞肝癌细胞SMCC-7721活力的影响随着作用浓度的增加，甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721活力抑制作用逐渐增强，在100 μg/mL时，抑制程度最大，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。
2.2甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡的影响正常肝癌细胞SMCC-7721中仅有少量的细胞发生早期凋亡和晚期凋亡；随着给药浓度的增加，早期和晚期凋亡细胞数均显着增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
*：P<0.01，与对照组比较。
图1 甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721活力的影响
a：P<0.01，与对照组比较。
表2 甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721线粒体膜电位及
a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较。
*：P<0.01，与对照组比较。
图2甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721中及CytC水平的影响
2.3甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721线粒体膜电位的影响随着给药浓度的增加，甘草酸苷可显着引起细胞线粒体膜电位去极化，且作用呈现浓度依赖关系，见表2。
2.4甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721中Caspase-3、Caspase-9活性的影响与对照组相比，随着给药浓度的增加，甘草酸苷能显着抑制肝癌细胞SMCC-7721中Caspase-3、Caspase-9活性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.5甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721中p53及CytC水平的影响与对照组相比，随着给药浓度的增加，甘草酸苷能显着抑制p53及CytC的表达，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图2。
2.6甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721中Bax、Bcl-2水平的影响与对照组相比，随着给药浓度的增加，甘草酸苷能显着提高Bax的表达，下调Bcl-2的表达，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图3。
*：P<0.01，与对照组比较。
图3甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721中Bax、Bcl-2水平的影响
3 讨 论
肝癌的发生不仅仅因为细胞增殖过度和分化异常，细胞程序性凋亡减少也可导致其发生。因此通过诱导肿瘤细胞凋亡使其重新恢复细胞凋亡能力，已成为肿瘤治疗目前的研究热点之一[5]。乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染是肝细胞癌产生的危险因素之一[1-2]。甘草酸苷具有抗病毒引起的肝炎[3]。因此本文通过MTT实验和 Annexin V-FITC流式细胞法检测甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721的作用，发现一定剂量甘草酸苷能显着抑制肝癌细胞SMCC-7721活力，诱导肝癌细胞SMCC-7721凋亡。
凋亡途径包括内源性和外源性两个通路，内源性通路由线粒体途径介导。线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡会使线粒体功能发生紊乱及障碍，而线粒体功能障碍反之也会促使自由基大量产生、兴奋性氨基酸大量释放、钙离子超载外，也能直接诱导细胞凋亡。当含Bcl-2家族的成员的在接受细胞内的死亡信号后被激活，会引起线粒体膜通透性明显升高，诱发CytC的释放，诱导Caspase-9的活化激活级联反应。Bax mRNA 表达低下或缺失参与了肝胆管癌的发生、发展过程[6]。Bcl-2过表达参与了肝癌的发生、发展及转移等过程[7]。通过线粒体途径及上调Bax表达、增加Bax/Bcl-2比率可诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡[8]。当甘草酸苷作用SMMC-721后，可提高Bax表达，抑制Bcl-2表达，提示甘草酸苷可通过调节Bax、Bcl-2蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。
CytC是一种水溶性蛋白，位于线粒体内外膜之间，并与内膜松弛相连，当线粒体受损后，线粒体通透性转变孔道开放，CytC从构建的空隙中进入细胞质中，引起后续的凋亡反应。线粒体的损伤为线粒体凋亡途径中标志性的指标。CytC的表达是肝癌细胞凋亡的晚期事件[9]。本试验发现，通过一定剂量甘草酸苷作用肝癌细胞SMCC-7721后，细胞质中CytC表达上升，线粒体去极化显着。Caspase-家族在程序性细胞死亡过程中发挥了关键的作用。Caspase-9是凋亡发生的启动者，而Caspase-3被认为是Caspase级联反应中最重要的执行者，活化的Caspase-3可以裂解PARP进而引起DNA的损伤，还可以诱导细胞骨架结构重构和瓦解[10]。Caspase-3低表达在肝癌中的发生、发展过程中起着重要作用[11]。Caspase-9的高表达参与了肝癌的发生过程[12]。本试验也证实肝癌细胞SMCC-7721中Caspase-3、Caspase-9活性较低，给予一定剂量的甘草酸苷能显着抑制Caspase-3、Caspase-9活性的上升。
p53在细胞凋亡引起的DNA损伤过程中是一个关键因素，它是第1个被证实的抑癌基因，其产物p53蛋白存在于正常的细胞内，参与细胞生长、分化和死亡，与肿瘤的发生密切相关。研究证实p53能够引起线粒体介导的Caspase依赖性凋亡的发生[13]。同时p53能够调节诱导凋亡与抗凋亡基因之间的平衡，而其激活也是凋亡所需的[14]。p53蛋白的低表达是肝癌细胞低分化，高转移潜能，预后差的生物学标志之一[15]。通过提高p53表达，能一定程度上诱导肝癌细胞SMCC-7721凋亡[16]。本试验也发现，肝癌细胞SMCC-7721中p53低表达，甘草酸苷作用后，可显着提高p53表达。
总之，一定剂量的甘草酸苷能诱导肝癌细胞SMCC-7721凋亡，是通过促进细胞线粒体膜电位去极化，上调p53、CytC、Bax的表达，下调Bcl-2的表达来实现。
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Induction of glycyrrhizin on apoptosis in hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721*
ZhengXiaoke1,WangLijuan1,ZhangHongqiao1,YangXiaoang2
(1.DepartmentofOncology,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;2.InstitudeofMedicine,UniversityofZhengzhou,Zhengzhou,Henan450052,China)
ObjectiveTo explore the molecular biological mechanism and induction of glycyrrhizin on apoptosis in hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721.MethodsMTT method was used to detect the viability of SMCC-7721 cells after the cells were cultured with glycyrrhizin of 0 (negative control),10,30 and 100 μg/mL.The mitochondrial membrane potential and cell apoptosis of SMCC-7721 cell was measured by flow cytometry.The activity of Caspase-3,Caspase-9 was assayed by spectrophotometric assay.The mitochondrial pathway related protein p53,cytochrome (CytC),Bax,Bcl-2 was assayed by Western blot.ResultsCompared with negative control group,10,30,100 μg/mL glycyrrhizin inhibited SMCC-7721 cell viability (P<0.01),induced SMCC-7721 cell apoptosis and promoted mitochondrial membrane potential depolarization (P<0.01),as well as inhibited the activity of Caspase-3 and Caspase-9 (P<0.01),upregulated the expression of p53,CytC,Bax(P<0.01) and down-regulated the expression of Bcl-2 (P<0.01).The effects were related with the medicine concentration in does-dependent.Conclusionglycyrrhizin could induce SMCC-7721 cell apoptosis,which might be related with mitochondrial pathway.
liver neoplasms；apoptosis；glycyrrhizic acid；hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721；glycyrrhizin；mitochondrial pathway
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.003
国家自然科学基金资助项目(81071724)。作者简介：郑晓珂(1980-)，主治医师，硕士，主要从事恶性肿瘤综合治疗研究。
R735.7
A
1671-8348(2016)14-1879-03
2015-11-12
2015-12-28)
