缺氧调控JAR细胞Stat3表达及细胞凋亡的研究*

杜尚珂，石　瑛，岳　宁，张琳琳，于海洋，贾莉婷，张　展

(郑州大学第三附属医院检验科　450052)



缺氧调控JAR细胞Stat3表达及细胞凋亡的研究*

杜尚珂，石瑛，岳宁，张琳琳，于海洋，贾莉婷，张展△

(郑州大学第三附属医院检验科450052)

[摘要]目的探讨缺氧对JAR细胞信号转导子和转录激活子3(Stat3)和磷酸化Stat3(p-Stat3)蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法在缺氧条件下培养JAR细胞，通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Stat3和p-Stat3在缺氧前后蛋白表达的差异，采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果缺氧培养JAR细胞48 h后，细胞形态发生异常改变，Stat3和p-Stat3蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，细胞凋亡水平明显增加(P<0.05)。结论缺氧使JAR细胞Stat3和p-Stat3蛋白表达水平降低，凋亡增加。

[关键词]细胞信号转导子和转录激活子3；缺氧；滋养细胞；凋亡

滋养细胞是母胎界面进行物质交换的主要场所，早期胚胎发育及胎盘形成是在相对缺氧环境中进行[1]。自妊娠11周起，滋养细胞浸润能力增加，缺氧状态得到改善，若持续低氧会阻碍正常妊娠进行，许多妊娠期疾病与滋养细胞缺氧有关[2-3]，如子痫前期(preeclampsia，PE)和胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)。信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcriptions，Stats)是介导细胞内信号转导的转录因子，包括6个亚型(Stat1～Stat6)，其中Stat3研究最为广泛。Stat3被激活时C-端的酪氨酸残基(TryY705)和丝氨酸残基(Ser727)位点发生磷酸化，形成磷酸化Stat3(p-Stat3)。p-Stat3调控机体细胞多项生理功能的基因转录，如增殖、侵袭、迁移及凋亡。在某些病理状态下发生异常表达，如肿瘤和子痫前期。目前，尚未有研究报道缺氧能否改变滋养细胞Stat3的表达情况，本研究通过低氧培养JAR细胞，检测缺氧后Stat3和p-Stat3在JAR细胞中的表达及细胞凋亡水平，探讨滋养细胞缺氧与缺氧性妊娠期疾病之间的关系。

1材料与方法

1.1材料人绒毛膜癌细胞JAR细胞系(美国ATCC公司)。试剂与仪器：高糖完全培养基(美国Geneview公司)，二氯化钴(CoCl2天津致远化工)，RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(鼎国公司)，蛋白浓度测定BCA 试剂盒(康为公司)，Stat3和p-Stat3兔抗人抗体(美国CST公司)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组培养JAR细胞至对数生长期，以1×105cell/L细胞密度接种于6孔培养板至细胞融合至80%时，更换无血清培养基处理细胞24 h，进行配对分组：正常组和缺氧处理组(加入CoCl2使其终浓度为300 μmol/L)，培养48 h后进行各项检测。

1.2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Trizol提取细胞总RNA，紫外吸收法进行RNA定量检测，各组RNA的吸光度(A)260/280均在1.8～2.0。cDNA逆转录按照逆转录试剂盒说明书操作。每组设置3个复孔，进行RT-PCR扩增。扩增反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min进行40个扩增循环，72 ℃延伸10 min，采用2-△△CT方法计算Stat3 mRNA的相对表达量。引物由上海捷瑞生物有限公司合成，β-actin为内参，引物序列，见表1。

表1　RT-PCR扩增的引物序列及扩增片段的大小

1.2.3蛋白免疫印迹法(Western blot)检测6孔板内细胞100 μL蛋白裂解液(加入1∶100的PMSF和磷酸酶抑制剂)。BCA法测总蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，TBST清洗膜后，加Stat3和p-Stat3一抗抗体，4 ℃摇床孵育过夜。加入二抗(1∶4 000)。用ODYSSEY Clx检测与成像系统进行扫描，分析条带的灰度值。以目的蛋白条带与内参灰度值之比作为结果。

1.2.4流式细胞术检测消化细胞制成细胞悬液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，400目筛子过滤，凋亡检测严格按照Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书进行操作，应用FACSCALLBUR流式细胞仪(美国BD公司)测定细胞荧光LYSISⅡ软件分析。

2结果

2.1正常和缺氧培养下JAR细胞形态观测JAR细胞缺氧培养48 h后，缺氧处理组细胞肉眼可见细胞凋亡增加，部分细胞形态发生改变，细胞由圆形或椭圆形变成纤维样或棘形样细胞，细胞胞质中出现黑色粗颗粒，见图1。

A：正常组；B：缺氧处理组。

图1缺氧处理JAR细胞形态图(×100)

2.2RT-PCR检测结果RT-PCR实验显示，JAR细胞经缺氧处理缺氧处理48 h后， Stat3 mRNA的相对表达水平为1.699±0.243，与正常组相比明显升高，差异有统计学意义(t=-2.871，P<0.05)，见图2。

*：P<0.05，与正常组比较。

图2缺氧培养JAR细胞48 h后Stat3 mRNA的表达水平

2.3Western blot检测结果Western blot检测显示，JAR细胞经缺氧处理48 h后，与正常组比较，Stat3和p-Stat3蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(t=-11.260、-42.784，P<0.05)，见图3。

A：Stat3和p-Stat3蛋白相对表达结果；B：Stat3蛋白相对表达水平；C：p-Stat3蛋白相对表达水平。*：P<0.05 ，与正常组比较。

图3缺氧培养JAR细胞48 h后Stat3和p-Stat3蛋白的表达结果

2.4流式细胞术检测结果通过流式细胞术检测凋亡实验结果可见，缺氧处理组的细胞凋亡率为(4.02±1.24)%，明显高于对照组(17.83±2.04)%，差异有统计学意义(t=6.692，P<0.05)，见图4。

A：正常组；B：缺氧处理组。

图4缺氧培养JAR细胞48 h后细胞凋亡水平

3讨论

氧气对滋养细胞增殖、分化和凋亡至关重要[4]。子痫前期胎盘滋养细胞及体外缺氧培养滋养细胞细胞凋亡均增加[5]。本研究采用CoCl2化学方法建立JAR细胞缺氧模型，JAR细胞为人绒毛膜癌的转化细胞，系滋养细胞来源，可提供滋养细胞功能方面研究；适当浓度的CoCl2能在正常氧分压下与Fe2+竞争性结合氧分子，从而达到细胞缺氧的目的。不同细胞系[6]造成细胞缺氧环境所需CoCl2的浓度不同，当CoCl2终浓度为300 μmol/L时，JAR细胞内HIF-1α表达水平显着升高，细胞生长抑制显着且无明显细胞毒性作用。多项研究以此类细胞系作为滋养细胞的缺氧模型[7]。

本研究缺氧处理JAR细胞48 h后检测Stat3的mRNA水平，以及Stat3和p-Stat3的蛋白表达水平，得出缺氧后Stat3 mRNA水平的变化与蛋白质水平变化不一致，Stat3的mRNA水平代表其基因转录时状态，但由于基因转录后存在更为复杂的翻译调控作用，因此mRNA水平并不能准确代表其蛋白质的表达水平，两者表达之间不完全成一致性；此外，基因在不同组织、细胞和时间中所受的各种调控不同也使两者之间不相关或负相关。缺氧环境下JAR细胞p-Stat3蛋白表达降低，且细胞发生明显凋亡。有研究发现恶性外周神经鞘瘤细胞中Stat3可通过HIF-1α信号通路对细胞发挥作用[8]，在缺血大鼠的肾脏和缺氧肾癌细胞中p-Stat3可通过阻碍HIF-1α蛋白降解或增加缺氧环境中HIF-1α的合成来促进细胞内HIF-1α水平升高，由此推测在缺氧JAR细胞中p-Stat3可能参与低氧调控的信号通路，进而参与细胞凋亡的发生。

细胞凋亡是细胞发生程序性死亡，在维持正常细胞生理功能中发挥重要作用，主要包括两条重要通路：膜受体凋亡通路和线粒体凋亡通路。Stat3作为细胞内重要的转录因子[9]，可调控多种凋亡蛋白(p53、Bax)和抗凋亡蛋白

的基因转录，发挥抑制细胞凋亡、促进细胞生存的作用。缺氧处理JAR细胞后，随着p-Stat3蛋白表达降低，可使其下游抗凋亡因子表达下降，从而导致细胞凋亡增加。有研究得出重度子痫前期胎盘滋养细胞中Stat3和p-Stat3的蛋白表达水平下降[10]，滋养细胞凋亡增加，与本课题研究结果一致。

综上所述，本研究结果表明缺氧可使p-Stat3蛋白表达降低，细胞凋亡增加。Stat3作为细胞内参与基因转录的蛋白，可协同其他信号通路共同发挥作用，深入探索缺氧和Stat3的相互关系可对缺氧性妊娠期疾病的病因、发病机制及预测、治疗提供新思路。

参考文献

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[3]Akhilesh M,Mahalingam V,Nalliah S,et al.Participation of hypoxia-inducible factor-1α in the pathogenesis of preeclampsia-related placental ischemia and its potential as a marker for preeclampsia[J].Biomarkers Genomic Med,2014,6(3):121-125.

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[5]Longtine MS,Chen B,Odibo AO,et al.Villous trophoblast apoptosis is elevated and restricted to cytotrophoblasts in pregnancies complicated by preeclampsia,IUGR,or preeclampsia with IUGR[J].Placenta,2012,33(5):352-359.

[6]Hong KH,Yoo SA,Kang SS,et al.Hypoxia induces expression of connective tissue growth factor in scleroderma skin fibroblasts[J].Clin Exp Immunol,2006,146(2):362-370.

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[8]Rad E,Dodd K,Thomas L,et al.STAT3 and HIF1α signaling drives oncogenic cellular phenotypes in malignant peripheral nerve sheath tumors[J].Mol Cancer Res,2015,13(7):1149-1160.

[9]Siveen KS,Sikka S,Surana R,et al.Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer:role of synthetic and natural inhibitors[J].Biochim Biophys Acta,2014,1845(2):136-154.

[10]Zhang Z,Yang X,Zhang L,et al.Decreased expression and activation of Stat3 in severe preeclampsia[J].J Mol Histol,2015,46(2):205-219.

The effects of hypoxia on the expression of Stat3 and the cell apoptosis*

Du Shangke,Shi Ying,Yue Ning,Zhang Linlin,Yu Haiyang,Jia Liting,Zhang Zhan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia on the expression of Stat3 and p-Stat3,and assessed the apoptosis ability of JAR cells in vitro.MethodsJAR cells were cultured under hypoxic conditions.Western blot were used to determine the protein expression of Stat3 and p-Stat3.Cellular apoptosis was monitored by flow cytometry analysis.ResultsAbnormal morphology changes in trophoblast cells under low oxygen conditions.After 48 h hypoxic treatment,the protein of Stat3 and p-Stat3 were significantly decreased(P<0.05);however,the level of apoptosis was significantly increased(P<0.05).ConclusionStat3 and p-Stat3 protein levels were decreased under hypoxia circumstance,while the cell apoptosis ability was increased in JAR cells.

[Key words]signal transducer and activator of transcriptions 3;hypoxia;trophoblast;apoptosis

doi:·论着·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.003

*基金项目：河南省科技创新人才计划项目(124200510005)。

作者简介：杜尚珂(1989-)，初级检验技师，硕士，主要从事生殖免疫研究工作。△通讯作者,Tel:18790802060；E-mail：zhangzhanzdsfy@126.com。

[中图分类号]R446

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)17-2312-02

(收稿日期：2015-11-23修回日期：2016-03-09)