王丽红，张香娜，王楠楠，黄 锦，杨百万，李 兴，王光明
(1.大理大学临床医学院2012级临床医学，云南大理 671000；2.大理大学附属医院病理科，云南大理 671000)
神经元特异核蛋白单克隆抗体的构建*
王丽红1，张香娜1，王楠楠1，黄锦1，杨百万1，李兴1，王光明2△
(1.大理大学临床医学院2012级临床医学，云南大理 671000；2.大理大学附属医院病理科，云南大理 671000)
目的根据Pubmed报道的FOX3 cDNA序列，构建神经元特异核蛋白(Neun)单克隆抗体。方法获得FOX3 cDNA序列，设计引物，PCR扩增，利用pcDNATM3.3-TOPO TA将纯化后的PCR产物插入真核表达载体中，得到FOX3蛋白，然后利用该蛋白免疫小鼠，免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，筛选后获得的杂交瘤细胞小鼠腹腔接种，收获腹腔积液后进行相关检测。结果所获得的腹腔积液经免疫印迹检测，在(46～48)×103处显示两条带，免疫荧光检测后细胞核显示阳性信号。结论根据FOX3 cDNA序列构建的抗体与商业化的抗Neun抗体在免疫荧光和免疫印迹上表现一致，Neun与FOX3为同一基因。
神经元特异核蛋白；FOX3；单克隆抗体
在1992年，Mullen等利用大鼠脑组织细胞核提取物免疫BALB/c小鼠，获得对神经元特异的单克隆抗体：mAb A60，该抗体识别所有脊椎动物神经元特异的核蛋白，把该抗原命名为神经元特异核蛋白(neuron-specific nuclear protein，NeuN)，已广泛用于神经科学、发育生物学和干细胞研究领域以及临床病理诊断中[1]。
然而，目前市面上的Neun抗体仅仅是Mullen等利用啮齿类动物脑组织蛋白提取物免疫动物获得的，其应用仅仅局限于科研领域,并且Neun基因的cDNA序列无法获得。2009年Kim等[2]研究发现认为NeuN属于Fox-1基因家族，命名为Fox3。因此本研究在2014年1月至2015年5月根据FOX3的序列进行FOX3抗体的克隆，经研究证实，FOX3与Neun为同一个基因，因此达到Neun抗体的国产化，现报道如下。
1 材料与方法
1.1材料人脑组织来源于大理大学临床医学院司法鉴定中心进行尸检的脑组织石蜡标本，材料使用获得本校医学伦理委员会和本院附属医院医学伦理委员会批准。
1.2方法
1.2.1tRNA的提取和cDNA的合成，引物设计和PCR扩增
1.2.1.1脑组织cDNA合成切取8片5 μm石蜡包埋组织,按照EASYspin 石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，中国)的说明书进行总RNA提取，按照cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司，美国)的说明书进行cDNA的合成。
1.2.1.2FOX3引物设计根据pubmed上人FOX3的cDNA序列(NM_001082575.2)，用gene runner软件设计引物，正义链：5′-ATG GCC CAG CCC TAC CCC CCC GCC CAG-3′；反义链：5′-TCA CAT GGT TCC AAT GCT GTA GGT CGC-3′。
1.2.1.3真核表达载体的构建依据如下条件进行PCR扩增，扩增试剂购自Invitrogen公司。起始变性95 ℃10 min，循环95 ℃10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸60 s，循环25次。PCR扩增后，PCR产物经OMEGA公司(美国)的Gel Extraction kit纯化后，利用pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning kit(Invitrogen公司，美国)将纯化后的PCR产物插入真核表达载体中，所获得的克隆经测序及电泳验证准确的载体命名为pcDNA-FOX3。
1.2.2重组蛋白FOX3的获得载体pcDNA-FOX3转染293细胞(CRL-1573，北京钧尧伟业生物科技有限公司)，有限稀释，G418筛选，获得单克隆。大量诱导表达生产，经过纯化，得到蛋白抗原用于免疫小鼠。
1.2.3动物免疫及杂交瘤细胞的获得
1.2.3.1动物免疫将成功获得的FOX3抗原与氢氧化铝佐剂制成的混悬液免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，然后分离免疫后的小鼠脾脏细胞用于细胞融合。
1.2.3.2细胞融合和单抗筛选利用纯化的FOX3抗原进行ELISA检测，在3只小鼠中免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，培养10～14 d对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此为阳性单克隆[3]。将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按(1～2)×106/管进行冻存。同时收集细胞用于腹水制备。
1.2.4腹腔积液制备和单克隆抗体检测
1.2.4.1腹腔积液制备细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹腔积液，细胞接种数量为5×106。接种10～14 d后收集腹腔积液。腹腔积液经Protein G柱纯化处理，浓缩后检测蛋白质浓度。
1.2.4.2免疫荧光染色小鼠的石蜡脑组织切片脱蜡到水后，0.3%甲醇双氧水溶液(甲醇∶30%过氧化氢=9∶1)室温孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤5 min。3次，然后用非免疫动物小鼠的血清1∶50稀释，孵育30 min，加入接种了杂交瘤细胞小鼠的腹腔积液稀释为0.1 ng/mL后，标本置于4 ℃过夜孵育，0.01 mol/L PBS洗涤5 min，3次，加入0.01 mol/L PBS稀释的Alexa Fluor 594标记的二抗(Thermo Fisher Scientific，美国)按体积比1∶1 000，室温孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤5 min，3次，10%丙三醇封片，荧光显微镜观察，染色结果与从美国Millipore公司(美国)购买的抗体“鼠抗人神经元特异核蛋白免疫组化单克隆抗体，MAB-0578”比较。
1.2.4.3免疫印迹检测大鼠、小鼠和人的脑组织用蛋白质裂解液(包括封闭液，洗涤液等购自北京博奥森生物技术有限公司)裂解后离心，按美国Bio-Rad公司的蛋白浓度测定试剂盒和上样缓冲液处理后SDS-PAGE电泳，转膜后在摇床上用封闭液封闭30 min，接种了杂交瘤细胞小鼠的腹腔积液稀释为0.04 ng/mL后4 ℃过夜孵育，洗涤液洗涤5 min，3次，加入抗体稀释液稀释的Alexa Fluor 594标记的二抗(1∶2 500)室温摇床上孵育30 min，洗涤液洗涤5 min，3次，蛋白印迹检测系统(ChemiDocMP，Bio-Rad公司，美国)检测结果与MAB-0578比较。
2 结 果
2.1基因克隆及抗体构建基本情况根据FOX3 cDNA序列设计的特异引物，经PCR扩增，凝胶电泳分析后可见1 200 bp左右的目的条带，见图1。PCR扩增得到的产物经胶回收试剂盒纯化后插入pcDNATM 3.3-TOPO TA载体中进行克隆，转化大肠杆菌后挑取15个克隆，分离质粒，送测序公司测序。测序结果与Pubmed上发表的FOX3 cDNA序列进行比对，得到1个克隆的序列与FOX3 cDNA序列完全一致，另外有两个克隆的序列与FOX3 cDNA序列比对后，分别出现1个和2个无义突变，其余的12个克隆均出现突变。
用序列完全正确的克隆转染293细胞，G418筛选后经PCR和免疫荧光检测，能够被Neun抗体识别的细胞克隆扩增后分离蛋白，然后用耦联有Neun抗体的磁珠进行纯化，洗脱后浓缩，得到的重组蛋白FOX3进行动物免疫。免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合后，进行筛选，得到了12个克隆；该12个克隆的细胞扩增后对雌性BALB/c健康小鼠进行腹腔接种，10～14 d后收集腹腔积液、纯化、浓缩，得到的样品用于后续的免疫荧光和免疫印迹。
M：Marker;S：样本。
图1FOX3全长cDNA PCR扩增
2.2免疫荧光检测结果上述筛选得到的12个克隆经免疫荧光染色检测，有两个杂交瘤细胞克隆所产生的腹腔积液(含单克隆抗体)，其染色结果与MAB-0578完全一致，见图2，均主要表现为细胞核阳性，其余克隆表现为细胞质阳性，称为阴性克隆。
A：鼠抗人神经元特异核蛋白免疫组化单克隆抗体；B：阴性克隆，细胞质着色；C：阳性克隆，主要在细胞核着色。
图2免疫荧光染色检测结果(×200)
2.3免疫印迹检测结果经免疫荧光筛选，可以识别大鼠、小鼠和人神经组织的神经元的产生腹腔积液的两个杂交瘤细胞克隆，本研究选择1个克隆对大鼠、小鼠和人神经组织提取物进行免疫印迹检测，其结果与MAB-0578完全一致，见图3。
A:构建的抗体为1抗；B:MAB-0578的抗体为1抗；M:Marker。
图3脑组织蛋白提取物免疫印迹检测
3 讨 论
mAb A60抗体可以识别所有脊椎动物神经元特异的核蛋白NeuN，已在神经科学、发育生物学和干细胞研究领域以及临床病理诊断中得到广泛应用[4-5]。但是由于该抗体是通过脑组织蛋白提取物免疫动物获得的，因此无法得到该基因的核酸序列，使得依赖于基因核酸序列的相关研究受到一定的限制。
2009年Kim等[2]通过体外细胞实验研究发现：Fox3阳性细胞表达的蛋白能够完全被NeuN抗体识别，另外Fox3的siRNA转染可以抑制NeuN在神经干细胞上的表达，从而认为NeuN属于Fox-1基因家族，命名为Fox3，但是二者是否完全一致还有待探讨[6]。虽然FOX3转染和FOX3沉默均可以用Neun抗体进行检测并得到了期望的结果，但是两者之间还有可能为上下游关系，也就是说存在这样的情况：基因FOX3的表达与否可以调控Neun的表达。因此为了确定FOX3和Neun为同一个基因，本研究以FOX3基因的cDNA序列为起点，经过一系列的分子生物学操作，构建FOX3抗体，然后与商业化的Neun抗体进行比较性研究。
抗体的构建包括单克隆抗体和多克隆抗体，但是前提必须能够获得抗原分子。在本研究中，由于Neun的基因序列未知，无法获得Neun抗原分子，因此只能够根据文献报道[2]： NeuN属于Fox-1基因家族，命名为Fox3，但是商品化的FOX3抗原仍然无法获得，然而Fox3基因的序列可以从pubmed数据库获得，并且该cDNA序列预期编码的蛋白质大小与Neun相似。因此，本研究通过分子生物学的方法，把Fox3 cDNA序列进行扩增，插入载体中，构建真核表达质粒，转染细胞后经过筛选等，获得了抗原，该抗原可以被Neun抗体识别。然后用FOX3重组蛋白免疫小鼠，得到可以产生FOX3抗体的脾细胞。为了保留脾细胞产生抗体的能力以及获得无限增殖的能力，把脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，这样获得的杂交瘤细胞保留了产生抗体的能力和无限增殖的能力。经过一系列的筛选，初步筛选准确的杂交瘤细胞克隆腹腔接种后获得腹腔积液。利用免疫荧光和免疫印迹检测，本研究所构建的单克隆抗体与商品化的抗体一致。
Neun抗原主要分布在神经元的细胞核内，而在本研究构建的克隆中，免疫组化染色时部分克隆表达在细胞质内，认定为阴性克隆，只有在细胞核内表达的才确定为阳性克隆。阳性克隆在免疫印迹检测中，与Mullen等的报道的结果一致：有(46～48)×103两条带，因此可以确定由FOX3基因的cDNA序列构建的抗体与商品化的Neun抗体为同一抗体，也就是说Neun与FOX3基因为同一基因。基因Neun(或者FOX3)在各种神经肿瘤中的表达特性预示着该抗体可以在病理诊断中发挥作用[6-8]，但是本研究构建的抗体经过一系列的检测才能够在临床病理诊断中应用。另外，文献介绍Neun在胚胎发育、干细胞分化、神经元的功能等方面具有重要作用[9-11]。通过本研究，确定了Neun基因与FOX3基因为同一个基因，为后续的研究提供了相关的信息。在引起神经元死亡的缺血性中风中，NeuN作为判断神经元是否“健康”以及治疗后疗效检测的指标[12]。对缺血90 min然后再灌流小鼠的研究中发现，短时间的灌流，在TTC染色还未能够检测到皮质损伤时，NeuN的表达就已经发生改变[13-14]。甲氟磷酸异己酯或氰戊菊酯(一种神经毒剂)暴露，神经元上NeuN的表达也发生改变[15]。因此需要通过大量的研究以阐明Neun在神经元的发育等方面的功能。
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Construction of the monoclonal antibody of neuron-specific nuclear protein*
WangLihong1,ZhangXiangna1,WangNannan1,HuangJin1,YangBaiwan1,LiXing1,WangGuangming2△
(1.Grade2012，ClinicalMedicineofClinicalCollege,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China；2.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China)
ObjectiveTo construct the monoclonal antibody of anti-Neun basis on the sequence of FOX3 cDNA published on Pubmed.MethodsThe specific primers were designed basis on the sequence of FOX3 cDNA which was amplified with RT-PCR,then the PCR product was inserted into pcDNATM3.3-TOPO TA to get the eukaryotic expression vector FOX3.The splenocyte from mice which were immunized with the protein of FOX3 was merged with SP2/0 cell line to gain hybridoma cell.The hybridoma cell was transplanted into the abdominal cavity of mice and the abdominal dropsy through selecting was collected and used into immunofluorescence staining and immunoblotting.ResultsThere were two specific bands from (46-48)×103through immunoblotting and positive cells through immunofluorescence staining.ConclusionThe antibody anti-Neun from the FOX3 cDNA sequence was showed the same information from the commercialized Neun antibody,through checking with immunofluorescence staining and immunoblotting.The gene Neun was as same as to gene FOX3.
neuron-specific nuclear protein;FOX3;monoclonal antibody
·技术与方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.027
国家自然科学基金资助项目(81360206)；云南省中青年学术技术带头人后备人才基金(2014HB025)；云南省创新创业训练计划建设项目(S-CXCY-2014-6)；大理学院博士科研基金资助项目(KYBS201207)。作者简介：王丽红(1993-)，本科，主要从事神经生物学的研究。△
，Tel：18313159589；Email：gmwang1991@hotmail.com。
R737.3； R361.3
A
1671-8348(2016)24-3393-03
2016-02-17
2016-04-29)
