黄雅娟，杜 峰，魏玲丽
(江西省妇幼保健院乳腺科 330006)
miR-335通过靶向生存素对乳腺癌细胞增殖的调控作用
黄雅娟，杜峰，魏玲丽
(江西省妇幼保健院乳腺科330006)
目的探讨miR-335通过靶向生存素对乳腺癌细胞增殖的调控作用。方法(1)选取乳腺癌组织及癌旁正常组织，分别采用RT-PCR、Western blot检测组织中miR-335及生存素蛋白表达。(2)选取乳腺癌细胞系MCF-7，分别转染miR-335 mimic及mimic对照组，采用RT-PCR、Western blot检测组织中miR-335及生存素蛋白表达。(3)选取乳腺癌细胞系MCF-7，分别将野生型survivin 3′-UTR质粒(survivin-wt)和突变型survivin 3′-UTR质粒(survivin-Mut)与miR-335 mimic或模拟物阴性对照(NC)共转染至乳腺癌细胞系MCF-7，双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性。(4)选取乳腺癌细胞系MCF-7，分别转染mimic对照组、miR-335 mimic及miR-335 mimic+survivin，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖活性。结果(1)与癌旁组织相比较，乳腺癌组织中miR-335表达显着降低(P<0.05)，同时生存素蛋白表达显着增高(P<0.05)。(2)与转染mimic对照组相比较，转染miR-335 mimic可使乳腺癌细胞MCF-7中miR-335表达上调(P<0.05)，同时生存素蛋白表达表达下调(P<0.05)。(3)与转染NC相比较，共转染miR-335 mimic与survivin-wt可使MCF-7荧光素酶活性降低(P<0.05)，而共转染miR-335 mimic与survivin-Mut则MCF-7荧光素酶活性无显着性变化(P>0.05)。(4)转染miR-335mimic后，MCF-7增殖活性较转染mimic对照组显着降低(P<0.05)；而转染miR-335 mimic+survivin后，MCF-7增殖活性较单纯转染miR-335 mimic显着提高(P<0.05)，但仍显着低于转染mimic对照组(P<0.05)。结论在乳腺癌组织中miR-335呈现低表达，生存素呈现高表达；而miR-335可通过靶向生存素抑制乳腺癌细胞系MCF-7增殖。
微RNAs;乳腺肿瘤；细胞增殖；miR-335；生存素
近年来，我国乳腺癌发病率逐年上升，并有年轻化发展趋势[1]。乳腺癌根治术是治疗早期乳腺癌的可靠手段，但由于起病隐匿，大多数患者临床确诊时已为晚期，从而错失实施根治手术的最佳时机。包括放疗、化疗及内分泌治疗在内的辅助治疗手段虽已广泛应用于乳腺癌临床治疗，但其所致的毒副反应及耐药性也不容忽视[2]。因此，寻求更安全、高效的乳腺癌治疗方法是临床亟待解决的重点及难点问题。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，其可通过调控一个或多个靶基因翻译，参与恶性肿瘤的发生与发展[3]。miR-335定位于人类7q32.2[4]。研究证实，乳腺癌细胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231中miR-335表达均显着低于正常乳腺细胞系MCF-10A(P<0.05)，而过表达miR-335则可对乳腺癌细胞生物学特性产生影响，提示miR-335可能参与乳腺癌的进展过程[5]。但miR-335对其下游靶基因的调控作用及机制尚未明确。Yang等[6]研究发现，miR-335可通过靶向生存素(survivin)实现对胃癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的抑制。而miR-335靶向生存素对乳腺癌的影响尚未可知。针对上述问题，本研究拟选取乳腺癌组织样本及乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象，观察miR-335靶向生存素对乳腺癌细胞系MCF-7增殖的调控作用，旨在为乳腺癌细胞的分子靶向治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1一般资料2015年7～12月30例女性乳腺癌组织及癌旁正常组织，由江西省妇幼保健院提供，均为手术切除的新鲜样本，术前告知患者并签订知情同意书，研究经江西省妇幼保健院伦理委员会批准。30例患者中，年龄27～65岁，平均(52.4±6.5)；WHO分级：1+2级 4例，3级 26例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ期21例。Her-2阴性24例，阳性6例；ER阴性11例，阳性19例；PR阴性14例，阳性16例；复发21例，未复发9例。
1.2材料乳腺癌细胞系MCF-7，购于美国ATCC细胞库；RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂盒、反转录试剂盒、miR-335模拟物(miR-335 mimic)、模拟物阴性对照(NC)、survivin 3′-UTR质粒，购于美国Invitrogen公司；Dual luciferase assays，购于美国Promega公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、链霉素、青霉素，购于美国Sigma公司；一抗survivin、β-actin，购于大连Santa Cruz公司；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒，购于碧云天生物试剂有限公司；miR-335、U6引物，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3方法
1.3.1细胞培养常规复苏乳腺癌细胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%双抗(青链霉素)的DMEM培养液重悬浮细胞，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液1次，收集对数生长期细胞，提取细胞总RNA及总蛋白待进行后续实验。
1.3.2细胞转染收集对数生长期的乳腺癌细胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%双抗(青链霉素)的DMEM培养液将细胞密度调节至2×105cell/well，后接种于6孔板中，共9孔，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h；将上述9孔细胞随机分为3组，每组3孔，即mimic对照组、miR-335 mimic 组及miR-335 mimic+survivin组，根据上述分组不同，利用LipofectamineTM2000转染miR-335mimic(50 nmol/L)、相应的mimic对照组(50 nmol/L)及survivin表达质粒(50 nmol/L)；转染后将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h；收集细胞总RNA及总蛋白待进行后续实验。
1.3.3双荧光素酶报告基因检测分别构建含有野生型survivin 3′-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒(survivin-wt)和含有突变型survivin 3′-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒(survivin-Mut)。收集对数生长期的乳腺癌细胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%双抗(青链霉素)的DMEM培养液将细胞密度调节至2×105cell/well，后接种于24孔板中，将survivin-wt质粒与miR-335 mimic或NC共转染至乳腺癌细胞系MCF-7，将survivin-Mut质粒与miR-335 mimic或NC共转染至乳腺癌细胞系MCF-7，每组设3个复孔，将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h；采用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性，以海肾质粒荧光值作为内参。
1.3.4MTT法检测细胞增殖收集对数生长期的乳腺癌细胞系MCF-7，按方法1.3.2对细胞进行分组并转染，转染结束后每孔加入MTT(5 mg/mL)20μL，37 ℃、5% CO2培养箱继续4 h；利用MTT法检测HSC增殖活性，即培养结束后，800 r/min离心10 min，弃上清液，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，继续置于37 ℃、5% CO2培养箱4 h进行显色实验，后吸弃孔内培养上清液，每孔加入100 μL DMSO终止显色，振荡10 min，使结晶物充分溶液，采用全自动酶标仪测测A490nm吸光值。
1.3.5Real-time PCR检测miR-335表达采集经处理后的乳腺癌细胞系MCF-7、乳腺癌组织标本及癌旁组织样本，参照Trizol试剂盒说明书提取细胞或组织中的总RNA，利用反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，取逆转录产物加入SYBR Green法行RT-PCR。miR-335以U6为内参，miR-335相对表达量为miR-335与U6拷贝数比值。miR-335序列 (5′-3′)：上游5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC G-3′；下游5′-AGG TAT TCG CAC TGG ATA CGA CA-3′。U6序列 (5′-3′)：上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。
1.3.6Western blot法检测survivin蛋白表达采集经处理后的乳腺癌细胞系MCF-7、乳腺癌组织标本及癌旁组织样本，常规提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取适量样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4 ℃封闭4 h，后依次加入一抗(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。
2 结 果
2.1乳腺癌组织、癌旁正常组织中miR-335、survivin表达及相关性RT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比较，乳腺癌组织中miR-335表达显着降低(P<0.05)，见图1。 Western blot结果显示，与癌旁正常组织相比较，乳腺癌组织中survivin蛋白表达显着增高(P<0.05)，见图2。Pearson相关性分析结果显示，乳腺癌组织中miR-335与survivin蛋白表达水平呈负相关(r=-0.327，P=0.014)。
2.2转染miR-335 mimic对乳腺癌细胞MCF-7中miR-335、survivin表达的影响RT-PCR结果显示，与转染mimic对照组相比较，转染miR-335 mimic可使乳腺癌细胞MCF-7中miR-335表达显着上调(P<0.05)，见图3。Western blot结果显示，与转染mimic对照组相比较，转染miR-335 mimic可使乳腺癌细胞MCF-7中survivin表达显着下调(P<0.05)，见图4。
a：P<0.05，与癌旁组织相比较。
图1乳腺癌组织及癌旁正常组织中miR-335表达
1～5：乳腺癌组织；6～10：癌旁正常组织；A：Western bllot蛋白条带；B：蛋白定量分析结果；a：P<0.05，与癌旁组织相比较。
图2乳腺癌组织及癌旁组织中survivin蛋白表达
a：P<0.05，与mimic对照组相比较。
图3转染miR-335 mimic对乳腺癌细胞MCF-7中miR-335表达的影响
2.3miR-335对survivin 3′-UTR的靶向作用双荧光素酶活性检测结果显示，共转染miR-335 mimic与survivin 3′-UTR野生质粒后，乳腺癌细胞MCF-7荧光素酶活性较NC组显着降低(P<0.05)；共转染miR-335 mimic与survivin 3′-UTR突变质粒后，乳腺癌细胞MCF-7荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。
2.4转染miR-335 mimic、survivin乳腺癌细胞MCF-7增殖活性的影响MTT法检测结果显示，转染miR-335mimic 24 h、48 h及72 h后，乳腺癌细胞MCF-7增殖活性较转染mimic对照组显着降低(P<0.05)；而共转染miR-335 mimic、survivin后，乳腺癌细胞MCF-7增殖活性较单纯转染miR-335 mimic显着提高(P<0.05)，但仍显着低于转染mimic对照组(P<0.05)，见图6。
1～5：转染miR-335 mimic；6～10：转染mimic对照组；A：Western blot 蛋白条带；B：蛋白定量分析结果；a：P<0.05，与mimic对照组相比较。
图4转染miR-335 mimic对乳腺癌细胞MCF-7中survivin蛋白表达的影响
a：P<0.05，与NC组相比较。
图5双荧光素酶报告基因检测乳腺癌细胞MCF-7中miR-335
a:P<0.05，与mimic对照组相比较；b：P<0.05，与miR-335 mimic组相比较。
图6转染miR-335 mimic、survivin对乳腺癌细胞MCF-7增殖活性的影响
3 讨 论
既往研究表明，miRNA参与了众多病理生理过程，尤其是通过发挥类似抑癌或促癌基因的作用，参与恶性肿瘤的发生、发展过程[7]。miR-335已被证实在多种恶性肿瘤中差异表达。但不同恶性肿瘤中miR-335表达趋势并不相同。王鹤等[8]研究证实，miR-335在非小细胞肺癌组织中呈现高表达状态，而抑制miR-335表达可起到抑制非小细胞肺癌细胞SPCA-1迁移、侵袭及增殖能力的作用，提示miR-335在非小细胞肺癌中发挥类似促癌基因功能。而王勇等[9]研究发现，miR-335在骨肉瘤组织中呈现低表达，并可通过靶向rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)发挥类似抑癌基因功能。本研究结果显示，乳腺癌中miR-335表达显着低于癌旁组织(P<0.05)；而转染miR-335 mimic可使乳腺癌细胞MCF-7中miR-335表达上调，并对乳腺癌细胞MCF-7增殖活性起到一定程度的抑制作用，提示miR-335在乳腺癌的进展过程中发挥着类似抑癌基因的功能[10]。
生存素属于凋亡抑制蛋白家族成员，是目前已知的活性最强的抗凋亡因子，其在恶性肿瘤的增殖、凋亡过程中发挥至关重要的作用。生存素高表达在食管癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤组织中已得到证实[11-12]。生物信息学基因组预测提示：生存素可能是miRNA-335的靶向基因之一。但miRNA-335是否可通过靶向生存素参与乳腺癌细胞增殖及凋亡过程尚未可知。本研究结果显示，乳腺癌组织中生存素蛋白表达显着高于癌旁组织(P<0.05)，而转染miR-335 mimic可使MCF-7中生存素蛋白表达得到显着抑制，提示乳腺癌中miR-335表达与生存素蛋白表达存在一定相关性，而这种相关性很可能是由miR-335负向调控生存素所致[13]。双荧光素酶报告基因检测结果显示，共转染miR-335 mimic与survivin-WT可使乳腺癌细胞荧光酶活性降低，而共转染miR-335 mimic与survivin-Mut则对乳腺癌细胞荧光酶活性无影响，提示miR-335可特异性与survivin 3′-UTR结合，进而为miR-335靶向生存素提供有力佐证。MTT法检测结果证实，单纯转染miR-335可显着抑制MCF-7增殖，而共转染miR-335及生存素可实现miR-335对MCF-7增殖抑制作用的部分逆转，提示miR-335靶向生存素是调控MCF-7增殖活性的重要机制。但值得注意的是，转染生存素并无法完全逆转miR-335对MCF-7增殖的抑制，分析其原因可能与miR-335靶基因众多有关。目前已知的miR-335靶基因包括Sp1、ROCK1、HER3等，而miR-335靶向生存素可能仅是miR-335调控乳腺癌增殖的其中一个机制[14-15]。
综上所述，miR-335可通过靶向生存素参与乳腺癌细胞增殖过程；此外，miR-335还可能通过靶向其他下游基因参与乳腺癌的发生与发展。
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miR-335 regulate cell proliferation by targeting survivin in breast cancer cells MCF-7
Huang Yajuan,Du Feng,Wei Lingli
(DepartmentofGalactophore,JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)
ObjectiveTo evaluate the effect of miR-335 regulate cell proliferation by targeting survivin in breast cancer cells MCF-7.Methods(1)Chose breast cancer tissue and para-carcinoma tissue,and used RT-PCR or Western blot to detect the expression of miR-335 and survivin protein.(2)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively transfected miR-335 mimic and mimic control.The expression of miR-335 and survivin protein were detected by RT-PCR or Western blot.(3)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively co-transfection wild type survivin 3′-UTR(survivin-wt)or mutant type urvivin 3′-UTR(survivin-Mut)and miR-335 mimic or negative control(NC)to breast cancer cells MCF-7.The cell luciferase activity were detected by dual-luciferase report gene experiment.(4)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively transfected mimic control,miR-335 mimic and miR-335 mimic+survivin.The cell proliferation activity of each group were detected by MTT method.Results(1)Compared with para-carcinoma tissue,the miR-335 expression of breast cancer tissue significantly decreased(P<0.05),and the survivin protein expression of breast cancer tissue significantly increased(P<0.05).(2)Compared with transfection mimic control,transfection miR-335 mimic can made the miR-335 expression of MCF-7 increased(P<0.05),and made the survivin protein expression of MCF-7 decreased(P<0.05).(3)Compared with transfection NC,co-transfection miR-335 mimic and survivin-wt can made luciferase activity of MCF-7 significantly decreased(P<0.05),but the luciferase activity of MCF-7 was not significantly changes after co-transfection miR-335 mimic and survivin-Mut (P>0.05).(4)Compared with transfection mimic control,the MCF-7 proliferative activity significantly decreased after transfection miR-335mimic(P<0.05).Compared with transfection miR-335 mimic,the MCF-7 proliferative activity significantly increased after transfection miR-335 mimic+survivin(P<0.05),but still lower than transfection mimic control(P<0.05).ConclusionIn breast cancer tissue,the miR-335 show low expression,and survivin show high expression.miR-335 can target survivin to inhibit the proliferation activity of breast cancer cells MCF-7.
microRNAs;breast neoplasms;cell proliferation;miR-335;survivin
黄雅娟(1979-)，主治医师，本科，主要从事乳腺癌的综合治疗的研究。
·论着·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.003
R737.9
A
1671-8348(2016)27-3753-04
2016-02-17
2016-04-06)
