闵亚丽，黄 健，杨 静，刘 畅，于 黔
(贵州省贵阳市第一人民医院肾内科 550002)
Wnt/β-catenin信号通路在肾缺血再灌注致慢性肾间质纤维化大鼠中的表达
闵亚丽，黄 健，杨 静，刘 畅，于 黔
(贵州省贵阳市第一人民医院肾内科 550002)
目的 观察Wnt/β-catenin信号通路在肾缺血再灌注(IRI)致慢性肾间质纤维化大鼠模型中的表达。方法 将SD大鼠分为3组，即假手术组(Sham组)及IRI 7d组、IRI 14d组。分离左侧肾动脉，IRI组用无创血管夹夹闭左侧肾动脉，35min后去除血管夹；假手术组不夹闭左侧肾动脉。IRI 7d组与IRI 14d组分别于术后第6、13天切除右侧肾，分别于第7、14天处死大鼠。观察比较3组大鼠肾功能，蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3组肾组织β-catenin、纤维连接蛋白(Fibronectin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平，免疫组织化学观察β-catenin表达部位，生化染色检测胶原含量，Masson染色观察比较3组病理改变。 结果 与Sham组相比，IRI 7d组Fibronectin、α-SMA、胶原含量无明显增高，病理无明显肾小管间质纤维化;而IRI 14d组Fibronectin、α-SMA的蛋白表达水平则明显增高，胶原含量增多，肾功能减退，病理显示肾小管间质纤维化。与Sham组相比，IRI 7d组β-catenin表达增高，IRI 14d组较IRI 7d组增高更显着。结论 Wnt/β-catenin信号通路可能在肾IRI致慢性肾间质纤维化病程中发挥一定作用。
Wnt/β-catenin信号通路；肾缺血再灌注；慢性肾间质纤维化
严重的肾缺血再灌注(ischemia reperfusion injury，IRI)损伤不仅可引起急性肾功能衰竭,也可以导致肾小管间质纤维化。肾IRI损伤是肾移植时不可避免的病理损伤过程，可导致急性肾小管坏死，排斥反应增加，最终可引起移植器官功能减退及衰竭。而随着肾移植、心血管疾病、血管手术的增多，IRI致肾小管间质纤维化的趋势也逐年增多，探讨其发病机制及防治措施日益受到重视。Wnt/β-catenin信号通路在多种原因导致的肾纤维化的发生、发展中起重要作用。有研究发现缺血再灌注引起急性肾损伤时Wnt/β-catenin信号通路被激活，并可能参与了肾小管上皮细胞的修复，但在IRI所致慢性肾间质纤维化中的作用研究甚少[1]。因此，笔者观察了不同时间Wnt/β-catenin信号通路在IRI致肾小管间质纤维化大鼠模型中的表达，探讨其作用机制及可能的治疗方案。
1 材料与方法
1.1 材料 选用雄性SD大鼠20只(购自于贵州医科大学动物实验中心),体质量180～200g,分为假手术组(Sham组,n=6)、肾IRI 7d组(IRI 7d组，n=7)、肾IRI 14d组(IRI 14d组，n=7)。以5%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉。IRI两组游离后用无创血管夹夹闭左侧肾动脉，35min后去除血管夹，缝合伤口，常规喂养，IRI 7d组及IRI 14d组分别在术后第6、13天切除右肾，分别在术后第7、14天处死大鼠。处死前腹主动脉取血，分离血清，测定血肌酐。留取左肾组织部分置于4%甲醛溶液固定后用于病理切片染色，部分放入-80℃低温冻存冰箱以备提蛋白及做冰冻切片。Sham组游离左侧肾动脉但不夹闭，第13天切除右肾，第14天处死留取血清及左肾组织。
1.2 方法
1.2.1 肾功能测定 大鼠处死前下腔静脉穿刺采血，分离血清，测定血清肌酐(Scr)水平，检测仪器为全自动生化仪。
1.2.2 肾脏组织学检查 肾组织经10%中性缓冲甲醛过夜，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚度3μm)后，Masson染色分析。
1.2.3 肾脏免疫组织化学 采用ABC法检测β-catenin的表达。石蜡切片常规脱蜡，3% H2O2室温孵育10min，浸入柠檬酸盐缓冲液微波修复20min，牛血清封闭20min，滴加β-catenin Ⅰ抗(Santa Cruz)，4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，Ⅱ抗孵育1h，加入ABC复合物，暗室孵育30min,冲洗后加入显色液，显色10～30min，显微镜下观察，苏木素衬染，封片。同时采用PBS代替一抗作为对照。
1.2.4 生化染色法检测 采用天狼猩红/快速绿色胶原染色试剂盒检测胶原含量。10μm厚冰冻切片，PBS洗后，按试剂盒说明书操作，检测光密度(OD)540及OD605值，公式计算组织胶原量及非胶原量，计算胶原量所占百分比。
1.2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 用含蛋白酶抑制剂的组织裂解液提取肾脏总蛋白并用BCA法进行蛋白质定量，每条泳道30μg蛋白，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，分别加多克隆鼠抗β-catenin(Santa Cruz,1∶2000)、Fibronectin( Santa Cruz,1∶1000)、α-SMA(Santa Cruz,1∶10000)和Tubulin(上海康成，1∶10000)等，Ⅰ抗4℃孵育过夜。洗膜后，再加辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗。用增强化学发光系统显色，并曝光于X线片上，计算机图像分析系统分析条带的相对吸光度值。
2 结 果
2.1 血清肌酐 Sham组与IRI 7d组Scr比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而IRI 14d组Scr明显高于Sham组与IRI 7d组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 3组大鼠血清Scr、胶原的比较
2.2 肾脏组织Masson染色观察 各组肾小球未见明显异常，IRI 14d组肾小管上皮细胞肿胀，间质区增宽、部分胶原纤维沉积，少量炎性细胞浸润，肾间质纤维化。而Sham组与IRI 7d组比较无差异，见图1。
2.3 β-catenin免疫组织化学 Sham组β-catenin在肾间质只有少量表达。IRI 7d组与Sham组相比β-catenin表达增多。IRI 14d组与Sham组、IRI 7d组相比可见β-catenin在肾间质表达数量明显增多，见图2。
A:Sham组；B：IRI 7d组；C：IRI 14d组
A:Sham组；B：IRI 7d组；C：IRI 14d组
2.4 胶原含量 与Sham组及IRI 7d组比较，IRI 14d组胶原含量明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，而Sham组与IRI 7d组胶原含量，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.5 Western blot检测β-catenin、Fibronectin、α-SMA的蛋白表达水平 Sham组β-catenin、Fibronectin、α-SMA仅有微量表达。IRI 7d组β-catenin较Sham组有所增高(P<0.05)，IRI 14d组β-catenin较IRI 7d组增高更加显着(P<0.05)。Sham组与IRI 7d组Fibronectin、α-SMA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与Sham组及IRI 7d组相比，IRI 14d组Fibronectin、α-SMA蛋白表达水平明显上升(P<0.05)，见图3、表2。
图3 3组大鼠β-catenin、Fibronectin、α-SMA蛋白表达
表2 3组大鼠β-catenin、Fibronectin、α-SMA的蛋白水平比较
3 讨 论
肾IRI损伤的大部分研究集中在急性肾损伤，其致慢性肾小管间质纤维化的作用机制研究很少。近年来，随着肾移植手术、心血管疾病的增多，肾IRI导致的慢性肾损伤也逐渐增多并受到重视，因此，在本实验中采用肾IRI致肾间质纤维化大鼠模型来探讨其可能的发病机制及防治措施。
α-SMA是肌成纤维细胞的标志，后者是成纤维细胞的活化形式，也是细胞外基质包括胶原成分的重要来源。胶原是细胞外基质(EMC)的主要蛋白质成分，胶原含量多少可以直接反应肾纤维化程度的轻重。笔者将α-SMA、胶原、纤维连接蛋白作为提示肾小管间质纤维化的指标来观察IRI术后不同时间肾脏的病理改变。以前的动物实验发现，严重IRI所诱发的小管间质病变不能完全逆转，会进展为慢性的小管间质纤维化，并伴随肾小管浓缩功能的下降和蛋白尿的发生[2]。临床研究发现，缺血性肾功能衰竭的存活病例遗留有不同程度的慢性肾脏结构和功能损害[3]。蒋素华等[4]观察到持续夹闭大鼠两侧肾蒂40min造成肾脏缺血，5周后出现了较明显的肾小管间质纤维化病变。本研究发现：IRI术后7d肾功能与病理改变均与Sham组相似，Fibronectin、α-SMA的蛋白水平表达与Sham组相比亦无明显增高，但IRI 14d组血Scr明显升高，病理改变提示肾小管间质纤维化，Fibronectin、α-SMA的蛋白表达水平明显升高。提示肾脏IRI不仅可导致急性肾脏损伤也会引起慢性肾间质纤维化，对远期肾脏结构及功能有影响。Wnt/β-catenin信号通路已被证实在肾间质纤维化的发生、发展中发挥重要作用[5-6]。Wnt/β-catenin信号通路的核心分子是β-catenin，与α-catenin、E-cadherin等参与细胞间的黏附和细胞连接的构建；同时游离的β-catenin可进入细胞核，调节基因表达，参与多种细胞的增殖、分化和凋亡过程[7]。在单侧输尿管梗阻大鼠模型发现肾损伤后Wnt/β-catenin信号活化，伴随纤维连接蛋白及α-SMA的表达增高[8]。Hertig等[9]观察56例肾移植患者，3个月后肾脏波形蛋白表达增高，同时β-catenin由胞膜向胞质内转移，进入细胞核内的β-catenin增加，促进EMT的发生。近来也有研究发现选择性基因敲除β-catenin对肾纤维化程度影响较小，但可下调MMP-7，减轻间质成纤维细胞的凋亡[10]。不仅如此，肾纤维化中Wnt通路与TGF-1通路、PI3K/Akt通路和整合素连接酶(ILK)之间存在着重要的“crosstalk对话”[11-14]。TGF-1能诱导Wnt蛋白的分泌，在激活PI3K/Akt途径和ILK的同时，还能直接使糖原合成激酶-3发生磷酸化，使其活性受到抑制，最终导致“β-catenin/TGF-转录复合物”及相关转录因子激活，介导EMT过程[15]。笔者在本实验中发现IRI术后7d肾脏纤维化尚不明显时肾组织β-catenin即有增高，随着时间延长，IRI术后14d β-catenin增高更加显着，提示肾缺血再灌注致肾纤维化过程中Wnt/β-catenin信号通路激活，且早于肾间质纤维化出现之前，提示Wnt/β-catenin信号通路有可能在IRI所致肾小管间质纤维化病程中发挥重要作用。
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Expression of Wnt/β-catenin signaling pathway in chronic renal tubulointerstitial fibrosis induced by ischemia reperfusion injury in rats
Min Yali,Huang Jian,Yang Jing,Liu Chang,Yu Qian
(Department of Nephrology,Guiyang First People′s Hospital,Guiyang,Guizhou 550002China)
Objective To observe the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway in chronic renal tubulointerstitial fibrosis induced by ischemia reperfusion injury (IRI)in rat model.Methods SD rats were divided into three groups:sham group,IRI 7d group and IRI 14d group.Ischemia reperfusion injury in the rats of two IRI groups was made.The left renal artery was isolated,and the left renal artery was clamped with non invasive blood vessel in IRI group,and the left renal artery was removed after 35min.The sham group did not clamp the left renal artery.IRI 7d group and IRI 14d group were removed at sixth day and thirteenth day after surgery respectively.The rats were sacrificed at fourteenth day and seventh day respectively.Renal function were compared among the three groups of rats.The protein expression of β-catenin,fibronectin,α-SMA were detected by Western blot.The location of β-catenin was detected by immunohistochemistry,and the content of collagen was detected by biochemical staining.The pathological changes of the three groups were observed and compared by Masson staining.Results Compared with the rats of sham group and IRI 7d group,the protein expressin of Fibronectin,α-SMA and the level of collagen increased significantly in the rats of IRI 14d group.There was tubuloinsterstitial fibrosis in Masson staining in IRI 14d group.Compared with the sham group,the expression of β-catenin increased in the rats of IRI 7d group and increased more obviously in IRI 14d group.Conclusion Wnt/β-catenin signaling pathway may plays an importment role during the pathologic process of renal tubuloinsterstitial fibrosis induced by IRI.
Wnt/β-catenin signaling pathway；ischemia reperfusion injury；renal tubulointerstitial fibrosis
闵亚丽(1972-),副主任医师，硕士，主要从事肾小管间质纤维化的机制研究。
论着·基础研究
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.004
R692.5
A
1671-8348(2016)29-4044-03
2016-02-20
2016-04-27)
