禹 刚,简丽萍
(1.四川省阿坝州人民医院重症科,四川马尔康 624000;2.西南医科大学,四川泸州 646000)
谷氨酰胺对克雷伯杆菌引起的大鼠肺炎炎症的抑制作用
禹 刚1,简丽萍2
(1.四川省阿坝州人民医院重症科,四川马尔康 624000;2.西南医科大学,四川泸州 646000)
目的 探讨谷氨酰胺对克雷伯杆菌引起的大鼠肺炎炎症的抑制作用及机制。方法 将36只SD大鼠随机分为3组，正常组、模型组、谷氨酰胺组，通过气管滴入克雷伯杆菌建立大鼠肺炎模型，谷氨酰胺组在造模前1 d即腹腔注射10 mL/kg 谷氨酰胺，正常组和模型组给予等量生理盐水，连续给药7 d，大鼠脱颈处死，取肺组织及血清进行检测。称量记录右肺湿重及干重(W/D)，HE染色检测肺组织病理形态，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肺组织匀浆及血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量，RT-PCR检测核因子-κB(NF-κB)p65和NF-κB抑制蛋白(IκBα)mRNA表达，Western blot检测NF-κB p6和IκBα蛋白表达。结果 与模型组比较，谷氨酰胺组能降低W/D比值[5.98±0.29vs. 4.32±0.33(P<0.05)]，减轻肺组织充血水肿、炎性细胞浸润，改善肺组织形态，抑制血清和肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌(P<0.05)，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平(P<0.05)。结论 谷氨酰胺能抑制克雷伯杆菌引起的大鼠肺炎炎症，与抑制NF-κB信号通路有关。
谷氨酰胺；克雷伯菌，肺炎；肺炎；炎症；NF-κB信号通路
肺炎(pneumonia)是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由微生物、理化因素等造成，其中细菌性肺炎是最常见的肺炎，也是最常见的感染性疾病之一。肺炎克雷伯杆菌是细菌性肺炎最常见的革兰阴性条件致病菌，是新生儿和婴儿医院获得性肺炎的常见致病菌，常危及新生儿生命[1]。肺部感染时产生大量的炎性细胞因子，从而加重炎症症状。且核因子-κB(NF-κB) p65和IκBα在呼吸道炎症中具有关键作用，已成为治疗肺炎药物开发的潜在靶点[2-3]。谷氨酰胺是体内含量最为丰富的氨基酸，能在细胞信号水平抑制机体的过度炎性反应，对细胞、器官和机体产生保护作用[4-5]。如谷氨酰胺能改善铜绿假单胞菌引起的大鼠肺部感染[6]，能抑制慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血NF-κB活性[7]，并降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平[8]，从而达到抗炎作用。说明谷氨酰胺可能通过抑制NF-κB活性来治疗肺炎。因此，本研究通过克雷伯杆菌诱导大鼠肺炎，探讨谷氨酰胺是否通过NF-κB信号通路抑制炎症。
1 材料与方法
1.1 实验动物 (200±20)g的SD雄性大鼠36只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证书：SCXK(沪)2012-0002，室内温度控制为(23±2)℃，大鼠自由饮食和摄水。
1.2 仪器与试剂 力肽每100 mL含谷氨酰胺活性成分13.46 g(德国费森尤斯公司)；BCA法蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液(碧云天生物技术研究所)；TNF-α，IL-1β，IL-6 ELISA检测试剂盒(美国RB公司分装)；兔抗p65，pp65，IκBα，p-IκBα单克隆抗体(Epitmics公司)；电泳仪，转印电泳仪，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司)；-80 ℃冰箱(美国Thermo公司)。肺炎克雷伯杆菌(KP03813)购自重庆医科大学微生物学教研室，在琼脂平皿中培养，16～18 h后稀释配制成细菌混悬液，并通过比浊仪调节混悬液浓度，使其最终浓度为1.5×109cfu/mL备用。
1.3 肺炎大鼠模型建立及分组 将36只SD大鼠随机分为3组，正常组、模型组、谷氨酰胺组，谷氨酰胺组在造模前1 d即腹腔注射10 mL/kg 谷氨酰胺，正常组和模型组给予等量生理盐水，连续给药7 d，大鼠脱颈处死，取肺组织及血清进行检测。造模过程如下：10%水合氯醛麻醉大鼠后，颈部备皮消毒，无菌操作，切开颈部皮肤，暴露大鼠上段气管，用1 mL注射器经气管滴入0.15 mL菌液，正常组滴入等量的生理盐水后立即竖立大鼠于固定台，使大鼠保持直立位约1 min，以保证接种菌液因重力作用而入肺[9]。
1.4 肺湿重/干重比值(W/D) 取右肺中叶用PBS洗净，吸水纸吸除水分，称得湿重(W)，在80 ℃温箱干燥，48 h后再称干重(D)，求得W/D。
1.5 HE染色 肺组织标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，抗原修复，室温冷却30 min，PBS冲洗2次，一抗室温孵育，PBS冲洗2次，二抗(1∶100)37 ℃孵育，PBS洗涤2次，DAB溶液显色后冲洗、复染、脱水、透明、树胶封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.6 ELISA法检测TNF-α、IL-1β及IL-6水平 取20～50 mg右肺中叶于9倍生理盐水中搅碎，使组织匀浆化，离心收集上清液待测。根据ELISA试剂盒说明书检测肺组织匀浆及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。
1.7 RT-PCR检测 总RNA的提取参考trizol试剂盒(Invitrogen)使用说明书，引物设计见下表1。通过一步法RT-PCR试剂盒将RNA逆转录成cDNA并进行PCR扩增，获取5 μL扩增产物用于下一步2%的琼脂糖胶进行检测并拍照。引物分别加入25 μL PCR反应体系中，反应条件为94 ℃变性45 s，59 ℃复性45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环。
表1 RT-PCR引物
1.8 Western blot 各组取适量肺组织，按比例加入RIPA(10 μg/mL)裂解液和蛋白酶抑制剂，超声破碎制成组织匀浆，将破碎后的组织匀浆放置于冰中30 min，使组织彻底裂解，每隔10 min置于涡旋仪中震荡30 s，40 min后，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，小心吸取上清液，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，跑SDS凝胶电泳，湿法砖膜。一抗孵育，4 ℃过夜；漂洗后二抗室温孵育1～2 h。漂洗，滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用Quantity one软件对各抗体条带灰度值进行统计。
2 结 果
2.1 各组肺湿重/干重比值(W/D) 正常组、模型组和谷氨酰胺组W/D比值分别为4.08±0.43、5.98±0.29和4.32±0.33，模型组与其他两组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。
aa：P<0.01，与正常组和谷氨酰胺组比较。
图1 各组肺湿重/干重比值(W/D)
2.2 各组肺组织病理形态 正常组中肺泡腔充气良好，无红细胞渗出；模型组中肺组织充血水肿，炎性细胞因子浸润，肺泡腔有红细胞；谷氨酰胺组中肺组织轻度水肿，炎性细胞浸润程度较轻，见图2。
A：正常组，B：模型组，C：谷氨酰胺组。
图2 各组肺组织病理形态
2.3 各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β及IL-6含量 与正常组比较，模型组中TNF-α、IL-1β及IL-6含量显着提高(P<0.01)。与模型组比较，谷氨酰胺组中TNF-α、IL-1β及IL-6含量显着下降(P<0.05)，见表2。
表2 各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β及IL-6含量
*：P<0.01，与正常组和谷氨酰胺组比较。
2.4 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量 模型组中TNF-α、IL-1β及IL-6含量显着高于正常组(P<0.01)。谷氨酰胺组与模型组相比TNF-α、IL-1β及IL-6含量显着下降(P<0.05)，见表3。
表3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量
*：P<0.01，与正常组和谷氨酰胺组比较。
2.5 各组大鼠血清中NF-κB 信号通路mRNA的表达 与正常组比较，模型组中pp65及p-IκBα mRNA表达量上升(P<0.01)；与模型组比较，谷氨酰胺组中pp65及p-IκBα mRNA表达量降低(P<0.01)，见图3。
aa：P<0.01，与正常组和谷氨酰胺组比较。
图3 各组大鼠血清中NF-κB 信号通路mRNA的表达
2.6 各组大鼠血清中NF-κB信号通路蛋白的表达 与正常组比较，模型组中pp65及p-IκBα 蛋白表达量上升(P<0.01)；与模型组比较，谷氨酰胺组中pp65及p-IκBα mRNA表达量降低(P<0.01)，见图4。
aa：P<0.01，与正常组和谷氨酰胺组比较。
图4 各组大鼠血清中NF-κB 信号通路蛋白的表达
3 讨 论
克雷伯杆菌是最常见的革兰阴性条件致病菌。当克雷伯杆菌等细菌抵达下呼吸道，会引起肺泡毛细血管充血，水肿，肺泡内红细胞渗出及炎性细胞浸润等症状，因此本研究通过气道滴入克雷伯杆菌构建大鼠肺炎模型，经病理学检测结果与上述观点一致，证实模型构建成功。谷氨酰胺可以减轻内毒素血症小鼠炎症[10]，本研究也证实谷氨酰胺的干预能一定程度上缓解肺水肿、充血及炎症浸润。
谷氨酰胺是人体血液中含量最多的氨基酸，但在创伤、感染等情况下，机体内谷氨酰胺水平迅速下降，同时大量研究证实补充谷氨酰胺可能有助于抗炎作用。谷氨酰胺能抑制慢性阻塞性肺疾病患者外周血 NF-κB活性[7]，并降低TNF-α含量[8]，从而达到抗炎作用。谷氨酰胺能抑制内毒素血症Wistar幼鼠肠组织中NF-κB蛋白和mRNA的表达，并降低TNF-α含量[11-12]。从而提示了谷氨酰胺能够通过抑制NF-κB信号通路改善各种肺炎症状及其他疾病。而NF-κB p65和IκBα在呼吸道炎症中具有关键作用，已成为治疗肺炎药物开发的潜在靶点[2-3]。同时本实验结果也表明谷氨酰胺治疗组能抑制pp65、p-IκBα蛋白及mRNA的表达，从而证实了谷氨酰胺可作为NF-κB信号通路的抑制剂从而抑制肺炎炎症。而且谷氨酰胺能抑制败血症小鼠NF-κB的激活及细胞因子的表达，能显着降低肺中TNF-α和IL-6的表达[13]。谷氨酰胺能抑制缺血再灌注Wistar大鼠NF-κB及IL-6阳性表达，从而抑制黏膜损伤，促进肠、肺恢复[14]。说明谷氨酰胺能通过影响NF-κB信号通路活性从而调节其下游相关基因表达，因此本研究进一步探讨谷氨酰胺对于大鼠肺炎NF-κB下游炎症因子的影响。
NF-κB 能特异性结合于多种基因启动子或增强子κB 位点，并促进其转录。在细胞中最常见的作用形式为 p65及p50组成的二聚体，在生理条件下或未受刺激时与 IκB 结合，在病理条件或受到刺激时，IκB被降解，磷酸化，释放NF-κB p65，使其从细胞质转移到细胞核内，调节炎症相关基因的表达。NF-κB与TNF-α和IL-1β等细胞因子可形成复杂的调控网络，在肺炎过程中起着重要作用。TNF-α主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，可促进炎症部位白细胞的聚集和活化，加重炎症。IL-1β在传递信息，激活免疫细胞，介导T、B细胞活化，增殖与分化及在炎性反应中起重要作用。IL-6也主要由活化的巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞等分泌的细胞因子，是介导机体炎性反应的重要细胞因子，是炎症免疫反应的重要递质。在香烟诱导的肺炎肺组织中NF-κB活性升高的同时，伴有IL-1β、TNF-α等炎症因子含量升高[15]。而通过谷氨酰胺的干预，本实验也发现伴随着p65及IκBα磷酸化水平的降低，谷氨酰胺治疗组能显着降低肺组织匀浆及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，与Singleton等[13]，Zabot等[14]的研究结果类似，进而说明谷氨酰胺能使NF-κB信号通路丧失活性，从而抑制其下游炎症因子的表达，使得大鼠肺炎炎症得以减轻。
综上所述，谷氨酰胺组能降低W/D比值，减轻肺组织充血水肿、炎性细胞浸润，改善肺组织形态，抑制血清和肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平。
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Inhibition of glutamine on inflammation of rats with pneumonia induced by Klebsiella pneumonia
YuGang1，JianLiping2
(1.DepartmentofICU,People′sHospitalofAbaPrefecture,Barkam,Sichuan624000,China; 2.SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)
Objective To explore the inhibition effect of glutamine on the inflammation of rats with pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into the normal group, model group and glutamine treatment group. The rat pneumonia model was established by intratracheal instillation of Klebsiella Bacillus pneumonia.Results Compared with the model group, the glutamine treatment group could reduce the ratio of W/D(5.98±0.29)vs.(4.32±0.33)(P<0.05), alleviated the lung tissue edema, inflammatory cell infiltration and then improved the morphology of the lung tissue, inhibited the IL-6, IL-1 and TNF-α secretion in serum and lung homogenate(P<0.05), and inhibited the level of NF-κB p65 and IκBα phosphorylation.Conclusion Glutamine inhibits the inflammation of rats with pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae, which might be related to NF-κB signal pathway.
glutamine; Klebsiella pneumonia; pneumoniae; inflammation; NF-κB signal pathway
禹刚(1980-)，本科，主治医师，主要从事呼吸重症方面的研究。
��·基础研究
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.005
R563.1
A
1671-8348(2016)33-4622-03
2016-04-11
2016-07-13)
