曹 阳，吴 念，刘 桦
(重庆市第五人民医院普外科 400062)
EphB4在肝癌组织中的表达及临床意义
曹 阳，吴 念，刘 桦△
(重庆市第五人民医院普外科 400062)
目的 研究酪氨酸蛋白激酶受体EphB4在肝癌组织中的表达及临床意义，并分析EphB4对肝癌细胞增殖的影响。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化技术分析EphB4在60例肝癌组织与相应癌旁组织中的表达差异，分析EphB4在肝癌组织中的表达水平与肝癌患者临床病理学之间的相关性，进行单因素生存分析，MTS实验分析EphB4对肝癌细胞系SK-Hep-1活力的影响。结果 RT-PCR检测结果显示EphB4在肝癌组织中mRNA表达水平(1.39±0.80)。明显高于癌旁组织(0.56±0.33)，差异有统计学意义(P<0.01)；免疫组化分析发现EphB4在肝癌组织和癌旁组织中的阳性率分别为81.7%和23.3%；EphB4在肝癌组织中的表达与AFP水平、肿瘤大小、TNM分期相关(P<0.05)；EphB4蛋白表达阳性和阴性的肝癌患者3年生存率分别为22.5%和54.5%，差异有统计学意义(P<0.05)；过表达EphB4显着提高肝癌细胞增殖能力(P<0.05)。结论 EphB4在肝癌组织中表达显着上调，与肝癌进展和预后相关；并且EphB4能促进肝癌细胞增殖，其可作为肝癌进展的标志物之一。
肝肿瘤；EphB4；临床意义
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，致死率居恶性肿瘤的第二位，大多数病例发生于亚洲和非洲[1-2]。肝癌恶性程度高，转移率高，预后差，5年生存率不到10%[3]。其预后差的主要原因是不能早期发现、早期诊断和早期治疗。因此寻找新的肿瘤标志物，提高肝癌的早期诊断率，对改善预后具有重要的意义。EphB4属于Ephrin酪氨酸蛋白激酶受体家族，Ephrin受体构成了最大的受体酪氨酸激酶亚家族，并分成了2个亚群，EphA和EphB[4-5]。近年来，多项研究证实了EphB在多种人类恶性肿瘤中的临床意义，尤其是EphB4被证实在子宫内膜癌、乳腺癌、食管癌、结直肠癌组织中是高表达的，并且具有重要的临床意义[6-11]。本研究旨在检测EphB4在肝癌组织与癌旁组织间的表达差异，并分析EphB4在肝癌组织中表达的临床意义和其对肿瘤生长的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择本院肝胆外科2010年6月至2012年6月手术切除标本，肝癌组织和癌旁组织各60例。术后经病理科组织病理学诊断为肝癌，术前未经任何放化疗及免疫学治疗。术中取肝癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘大于3 cm)，立即冻存于液氮中。所有标本的获取均得到患者本人及家属同意。肝癌患者的临床病理资料：年龄32～69岁，平均(52±8)岁；男39例，女21例；有肝硬化35例，无肝硬化25例；有门脉癌栓23例，无门脉癌栓37例；有淋巴结转移20例，无淋巴结转移40例；HBsAg阳性41例，阴性19例；肿瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期30例。
1.2 方法
1.2.1 细胞株和试剂 SK-Hep-1细胞系购于ATCC(American Type Culture Collection)。EphB4质粒购于ADDGENE公司，质粒转染试剂购买自罗氏公司。TRIZOL和逆转录试剂盒购于TIGEN公司，SYBR Green Master Mix购于Roche公司。EphB4抗体购于Bioword公司，DAB试剂盒购于北京中衫金桥公司。MTS试剂购于Promega公司。
1.2.2 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) TRIZOL裂解组织并提取组织总RNA，按照逆转录试剂盒操作说明合成cNDA，PCR扩增目的基因EphB4和内参基因β-actin。EphB4上游引物：5′-CCT TCC TGC GGC TAA ACG AC-3′,下游引物：5′-GTT GAC TAG GAT GTT GCG AG-3′；β-actin上游引物：5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，下游引物：5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。每个样本重复3次。以2-△△CT计算目的基因的相对表达水平。
1.2.3 免疫组化 组织经石蜡包埋并制作成5 μm厚切片，常规脱蜡水化，微波抗原修复，3%的过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性；山羊血清室温孵育20 min，EphB4抗体(1∶100)稀释后滴加于切片上，湿盒4 ℃过夜；第2天以山羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min；DAB显色液室温孵育10 min，苏木精复染，脱水，封片。阳性表达为细胞质有棕黄色颗粒沉积，光镜下随机在每张切片中选择10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，并对细胞染色强度联合阳性细胞百分比进行评分[12]。评分细则如下：0分，阴性；1分，弱阳性；2分，中度阳性；3分，强阳性；阳性细胞百分比分级如下：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度和阳性细胞百分比评分相乘大于或等于1分则认为EphB4蛋白表达阳性。
1.2.4 细胞培养及转染 SK-Hep-1细胞培养于10% FBS，1% p/s的DMEM培养基中，在含5% CO2、37 ℃孵箱中常规培养。质粒转染严格按照试剂说明书操作。用无抗生素培养基给细胞换液后分别将2 μg Vector和EphB4质粒加入到含有200 μL opti-MEM培养基的EP管中，混匀后在EP管中加入6 μL转染试剂(质粒与转染试剂的比例为1∶3)，混匀；室温放置15 mL。均匀滴加质粒于6孔板中，放置于孵箱中。
1.2.5 MTS实验 细胞转染质粒24 h后，用胰酶消化，培养基中和后细胞计数，取6 000个细胞接种于96-well plate。分别在转染后 3、4、5、6 d滴加20 μL MTS试剂，5% CO2、37 ℃孵箱中静置1～4 h，490 nm读取样品吸光值。每个样品重复3次。
1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析，比较EphB4 mRNA表达差异采用t检验分析，EphB4蛋白表达与临床资料之间的相关性采用χ2检验，Kaplan-Meier Log Rank检验进行单因素生存分析，组间两两比较采用两因素方差分析检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肝癌组织和癌旁组织中EphB4 mRNA水平表达差异 RT-PCR检测发现60例肝癌组织中EphB4 mRNA相对表达值为1.39±0.80，癌旁组织中EphB4 mRNA相对表达值为0.56±0.33，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。
*:P<0.01。
图1 RT-PCR检测EphB4 mRNA在肝癌组织和癌旁组织中的差异
2.2 EphB4蛋白在肝癌组织中的表达 通过免疫组化进一步检测发现EphB4在肝癌组织中的阳性表达率为81.7%(49/60)，在癌旁组织中的阳性表达率为23.3%(14/60)。EphB4在肝癌组织中的表达水平显着高于癌旁组织。见图2。
A：肝癌组织；B：癌旁组织。
图2 EphB4蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达(SP×100)
2.3 EphB4蛋白表达与肝癌患者临床病理特征间的关系 EphB4蛋白在肝癌患者中的表达与AFP水平、肿瘤大小、肿瘤TNM分期有关(P<0.05)，与患者年龄、性别、有无肝硬化、有无门脉癌栓、有无淋巴转移、乙肝表面抗原(HBsAg)阴阳性无关(P>0.05)。见表1。
表1 EphB4表达与肝癌患者临床病理因素间的关系(n)
2.4 EphB4蛋白表达与肝癌患者预后的关系 根据对60例患者的3年随访结果和EphB4蛋白在肝癌组织中的表达进行Kaplan-Meier单因素生存分析，结果显示EphB4蛋白表达阳性组肝癌患者的3年生存率为22.5%，EphB4蛋白表达阴性组肝癌患者的3年生存率为54.5%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。
图3 不同组EphB4蛋白表达生存率曲线
2.5 EphB4对肝癌细胞增殖的影响 为进一步研究EphB4对肝癌细胞增殖的影响，首先在SK-Hep-1细胞中转染了Vector和EphB4过表达质粒，RT-PCR显示EphB4过表达有效(图4A)。分别对转染后3、4、5、6 d的细胞进行MTS实验，如图4B所示，EphB4显着提高SK-Hep-1细胞的增殖能力(P<0.05)。
A：RT-PCR检测EphB4的过表达水平；B：MTS实验分析EphB4对SK-Hep-1增殖的影响；*：P<0.05。
图4 EphB4对肝癌细胞增殖的影响
3 讨 论
近年来，越来越多的研究显示Eph信号通路在癌细胞的生长、分化、聚集、迁移和凋亡过程中具有重要的作用，Eph受体在多种恶性肿瘤中是高表达的，包括前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等[13]。最近，Eph受体在肝癌发生、发展中的作用也逐渐引起了研究人员的关注。据报道，EphA1在肝癌细胞中表达较高，EphA1沉默能显着抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[14]。EphA2在肝癌组织中的表达水平也较高，并且能通过Rac1/Akt/NF-κB信号通路促进肝癌细胞存活[15-16]。更有研究显示，EphA4参与了肝癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，进一步通过β1-整合素通路影响了肝癌细胞的侵袭和黏附[17]。也有报道发现EphB1的多态性与人们对肝癌的易感性有关[18]。EphB4属于Eph受体家族，在多种肿瘤细胞和组织中表达水平较高，如子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等[13]，并且与肿瘤细胞的形态、黏附、迁移、侵袭等密切相关[19]。在本研究中，也发现EphB4在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。这提示着EphB4可能与肝癌的进展有关并具有重要的临床意义。
EphB亚族中，EphB4高表达的临床意义引起了最广泛地关注。研究显示，EphB4的表达与乳房头颈鳞状细胞癌的临床分期、吸烟史和预后差有关[20-21]。根据组织病理学和远期生活质量评分，EphB4的高表达与恶性胶质瘤的无进展存活期有关[22]。在子宫颈癌中，EphB4的高表达与临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小和不良预后有关[23]。本研究也发现，肝癌组织中EphB4蛋白的高表达与AFP水平、肿瘤大小、临床分期有关。揭示着EphB4可能促进肿瘤生长和进展。对本研究的肝癌患者术后随访发现，肝癌组织中EphB4高表达的患者术后生存期明显低于EphB4低表达的患者，EphB4蛋白表达阳性组肝癌患者的3年生存率为22.5%，EphB4蛋白表达阴性组肝癌患者的3年生存率为54.5%，提示EphB4蛋白表达水平与肝癌患者良好预后呈负相关。这些结果揭示在肝癌中，EphB4可能是一种促癌作用因子。EphB4促进肿瘤进展的机制是多方面的，包括抑制凋亡信号通路和直接作用于相关的肿瘤细胞生长信号通路，如PI3K/Akt/MMP、JAK/Stat1 信号通路等[13]。本研究进一步发现EphB4能增强肝癌细胞活力，这为深入解析EphB4参与肿瘤的发生、发展机制研究奠定了基础。
综上所述，本研究发现EphB4在肝癌组织中高表达并且与临床TNM分期预后不良有关，这为评估肝癌患者预后和发展新的生物学治疗靶点提供了科学的依据。
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Expression of EphB4 in hepatocellular carcinoma tissues and its clinical significance
CaoYang,WuNian,LiuHua△
(DepartmentofGeneralSurgery,theFifthPeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400062,China)
Objective To study the expression of Ephrin-B4 receptor (EphB4) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its clinical significance,and to analyze the effect of EphB4 on the proliferation of HCC cells.Methods The expression level of EphB4 in HCC tissues and matched paracancerous liver tissues of 60 cases of HCC patients was assessed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry.The correlation between the expression of EphB4 in HCC tissues and clinical pathologic parameters was analyzed by chi-square test.Univariate survival analysis was carried out by Kaplan-Meier Log-rank test.The effect of EphB4 on the viability of HCC cells was furtherly analyzed by MTS.Results The results of RT-PCR showed that the mRNA level of EphB4 in HCC tissues (1.39±0.80) was significantly higher than in matched paracancerous liver tissues (0.56±0.33),the difference was statistically significant (P<0.01).Data from immunohistochemistry showed that the positive rates of EphB4 protein in HCC tissues and matched paracancerous liver tissues were 81.7% and 23.3%,respectively.Moreover,the expression of EphB4 in HCC tissues was relevant to AFP level,tumor size and TNM stage(P<0.05).The three-year survival rate of HCC patients with positive expression of EphB4 protein was 22.5%,and that of HCC patients with negative expression of EphB4 protein was 54.5%,the difference was statistically significant (P<0.05).Overexpression of EphB4 significantly enhanced the ability of hepatocellular carcinoma cell proliferation (P<0.05).Conclusion EphB4 expression was significantly up-regulated in HCC,which was associated with HCC progression and prognosis,and EphB4 could promote the proliferation of HCC cells,which could be used as a marker of HCC progression.
liver neoplasms;EphB4;clinical significance
曹阳(1978-)，主治医师，本科，主要从事肝胆疾病临床研究。△
��·临床研究
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.022
R737.5
A
1671-8348(2016)36-5110-03
2016-08-18
2016-10-26)
