杨光磊，胡岩芳，赵 珊，葛国庆，胡延伟，霍彩娟，彭林涛
(1.邢台市人民医院普外科，河北邢台 054031；2.邢台市人民医院神经内科，河北邢台 054031；3.河北医科大学第二医院肿瘤内科，石家庄 050000)
2016年度重庆市出版专项资金资助项目
低氧条件下HIF-1α及P-gp在结肠癌组织及多种细胞系中的表达
杨光磊1，胡岩芳2，赵 珊3，葛国庆1，胡延伟1，霍彩娟1，彭林涛1
(1.邢台市人民医院普外科，河北邢台 054031；2.邢台市人民医院神经内科，河北邢台 054031；3.河北医科大学第二医院肿瘤内科，石家庄 050000)
目的 探讨肿瘤低氧环境对低氧诱导因子1α(HIF-1α)及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响及二者的相关性。方法 选取2013年6月至2015年6月邢台市人民医院58例结肠癌患者手术切除后标本，采用免疫组织化学法检测HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中的表达情况，分析其与患者临床病理特征的关系；采用细胞爬片法检测常氧与低氧条件下HIF-1α与P-gp在结肠癌细胞株中的表达情况，并分析HIF-1α与P-gp表达的相关性。结果 58例患者结肠癌组织标本HIF-1α蛋白阳性表达率为58.62%，P-gp阳性表达率为46.55%；HIF-1α与P-gp阳性表达率在Dukes分期C+D期者均明显高于A+B期者，且有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)；HIF-1α与P-gp的表达呈正相关(r=0.574，P<0.01)。同一细胞株中，低氧下HIF-1α及P-gp表达水平均高于常氧，差异均有统计学意义(P<0.01)；而相同氧环境下不同结肠癌细胞株间HIF-1α及P-gp表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中存在过表达和共表达现象，在不同Dukes分期和是否伴随淋巴结转移等因素中二者阳性表达率存在明显差异，且HIF-1α与P-gp表达呈明显正相关；低氧可诱导结肠癌细胞中HIF-1α与P-gp蛋白表达水平的升高。
低氧诱导因子1α；P糖蛋白；结肠肿瘤
结肠癌是常见的临床恶性肿瘤之一，主要治疗手段有手术治疗、化学治疗及放射治疗等[1]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是发现最早、研究最多的药物流出蛋白，其在癌细胞中的作用类似于排出泵，通过把癌细胞中化学治疗药物外排而降低药效[2-3]。P-gp对不同大小多种分子产生作用，其大多为疏水分子，部分存在于细胞膜上。在传统的恶性肿瘤治疗中，P-gp既能和药物结合，又能和腺苷三磷酸(ATP)相结合，过表达的P-gp蛋白会使肿瘤细胞产生对多种化学治疗药物的耐药现象，导致药物的效应减弱甚至消失。有资料报道，复发和难治的白血病P-gp会增加。结肠癌中肿瘤细胞的缺氧现象非常常见，在肿瘤细胞缺氧的条件下，体内氧调节的关键基因低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)起重要作用。HIF-1在人和哺乳动物细胞内普遍存在，在常养下也会有表达，但合成的HIF-1蛋白很快就会被降解，只有在缺氧条件下HIF-1才能够稳定表达。HIF-1α与肿瘤的生长、浸润、转移等关系密切，且缺氧还可导致肿瘤细胞化疗疗效减低[4-5]。HIF-1α亚基在翻译后就会被降解，因此，在正常氧饱和下不能检测到亚基的表达，但在缺氧情况下，亚基的降解会被抑制。目前，关于HIF-1α与P-gp相互作用参与结肠癌发生及治疗过程的研究较少。故本研究通过免疫组织化学技术观察结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布情况，研究HIF-1α与P-gp在结肠癌组织及细胞系中的表达及相关性，进而探讨肿瘤低氧环境对HIF-1α及P-gp表达的影响及二者表达的变化关系，以期发现其在结肠癌发生中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年6月至2015年6月邢台市人民医院58例结肠癌患者手术切除后标本，其中男30例，女28例；年龄25～80岁，平均(54.23±1.27)岁；左半结肠30例，右半结肠28例；Dukes分期：A期12例，B期19例，C期18例，D期9例；分化程度：高分化9例，中分化26例，低分化23例；其中19例伴随淋巴结转移。所有患者均确诊为结肠癌，术前均未接受放化疗等治疗。HCT-116、HT-29、LoVo、SW480均为本室保存人结肠癌传代细胞系。本研究通过该院伦理委员会审批。
1.2 方法
1.2.1 HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中的表达检测 免疫组织化学法[6-7]：组织标本滴加3%过氧化氢，在37 ℃下孵育15 min，滴加1∶100比例稀释的一抗，4 ℃下孵育过夜；然后滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液，以阳性显色充分而背景无杂色干扰为标准，显微镜下观察显色。结果判定：每张切片在高倍镜(×400)下随机选5个观测点，每个观测点计数200个细胞，计算显色棕黄色颗粒的阳性细胞百分率，阳性细胞百分率大于或等于1%判为阳性片，阳性细胞数百分率小于1%判为阴性片。
1.2.2 HIF-1α与P-gp在结肠癌细胞株中的表达检测 细胞爬片法[8-9]：取生长状态良好的细胞，进行常规培养，1 d后对照组继续在常氧下培养，实验组更换新鲜培养基后进行低氧处理；滴加3%过氧化氢，在37 ℃下孵育15 min，滴加1∶100比例稀释的一抗，4 ℃下孵育过夜；然后滴加DAB显色液。结果经图像分析软件Image-Pro Plus鉴定，得到蛋白阳性信号平均吸光度(A)值用来比较表达差异。
2 结 果
2.1 结肠癌组织中HIF-1α与P-gp表达的免疫组织化学结果 HIF-1α蛋白主要在结肠癌细胞细胞质及细胞核中表达，见图1。P-gp主要在结肠癌细胞细胞质及细胞膜中表达，见图2。58份标本中，HIF-1α蛋白阳性表达率为58.62%(34/58)，P-gp为46.55%(27/58)，二者阳性表达率在Dukes分期C+D期者均明显高于A+B期者，差异均有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移者HIF-1α、P-gp阳性表达率高于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)；二者表达均不受患者年龄、性别、肿瘤分化程度及肿瘤位置的影响(P>0.05)，见表1。
2.3 HIF-1α与P-gp在结肠癌细胞株中表达的免疫细胞化学染色结果 HIF-1α与P-gp在结肠癌HCT-116、HT-29、LoVo、SW480等4种细胞株中均有表达。常氧下二者表达都很弱，低氧处理后二者表达明显增强；同一细胞株中，低氧下HIF-1α及P-gp表达水平均高于常氧，差异均有统计学意义(P<0.01)；而相同氧环境下不同结肠癌细胞株间HIF-1α及P-gp表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.2 结肠癌组织中HIF-1α与P-gp表达的相关性 HIF-1α与P-gp表达呈正相关(r=0.574，P<0.01)，见表2。
A:细胞质；B：细胞核
图1 HIF-1α蛋白在结肠癌细胞细胞质及细胞核中的表达
A:细胞质；B：细胞核
图2 P-gp在结肠癌细胞细胞质及细胞膜中的表达
*：P<0.05，与Dukes分期C+D期比较；#：P<0.05，与无淋巴结转移比较
表3 常氧及低氧条件下HIF-1α与P-gp在结肠癌细胞中的表达
*：P<0.01，与常氧下相同结肠癌细胞比较
3 讨 论
结肠癌的发病主要和高脂肪、低膳食纤维饮食相关，其慢性炎症会使肠癌的发生率比一般人群高。而缺氧的结肠癌，会使肿瘤细胞发生改变，不仅自身存活率增加，还会对其他药物产生耐药性，影响结肠癌的治疗效果。HIF-1在1992年被发现广泛存在于哺乳动物和人体细胞中，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单元构成[10]。HIF-1β主要存在于细胞核和细胞质中，而HIF-1α仅在缺氧条件下出现在细胞核中，常氧下则迅速降解，因此HIF-1α成为细胞缺氧情况下调控基因表达的主要转录因子之一[11-12]。目前来看，相当多的HIF-1α抑制药物效果比较弱，只能抑制肿瘤暂时的生长。据报道，用一种小分子抑制剂把前列腺癌细胞中的HIF-1α表达阻止后，它对细胞毒性药物的化疗效果提高[13]。因此，研究HIF-1α对肿瘤细胞的生长、浸润、转移和治疗的意义重大。P-gp蛋白是一个比较常见的保护细胞免受外来有害分子入侵的分子泵，是一种跨膜糖蛋白，具有能量依赖性“药泵”功能，又能和其他药物有效结合，通过把癌细胞中化学治疗药物外排而降低药效[13-14]。本课题通过研究HIF-1α与P-gp在结肠癌组织及细胞系中的表达及相关性，探讨肿瘤低氧环境对HIF-1α及P-gp表达的影响及二者表达的变化关系，以期发现其在结肠癌发生中的作用。
本研究结果显示，HIF-1α蛋白主要在结肠癌细胞细胞质及细胞核中表达，P-gp亦主要在结肠癌细胞细胞质及细胞膜中表达。在58例患者结肠癌组织标本中，HIF-1α蛋白阳性表达率为58.62%，P-gp为46.55%，二者阳性表达率在Dukes分期C+D期者均明显高于A+B期者(P<0.05)；有淋巴结转移者HIF-1α、P-gp阳性表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05)。表明可能由于P-gp的高表达，引起肿瘤化学治疗疗效降低，可导致肿瘤具有较强的浸润与转移能力[15]。因此，在临床监测结肠癌进展及转移时，可以把HIF-1α与P-gp的表达情况作为的一个重要指标[16]。
为进一步明确HIF-1α与P-gp在结肠癌中所起到的作用，本研究通过免疫细胞化学染色在常氧及低氧培养条件下检测4种结肠癌细胞株中HIF-1α与P-gp的表达情况，探讨肿瘤低氧环境对HIF-1α及P-gp表达的影响及二者表达的变化关系。结果显示：HIF-1α与P-gp在结肠癌HCT-116、HT-29、LoVo、SW480细胞株中均有表达。常氧下二者表达都很弱，低氧处理后二者表达均明显增强。同一细胞株中，低氧下HIF-1α及P-gp表达水平均高于常氧(P<0.01)；而相同氧环境下，不同结肠癌细胞株间HIF-1α及P-gp表达水平无明显差异(P>0.05)。说明低氧可以诱导结肠癌细胞株HIF-1α与P-gp的表达水平上升[17]。相关性分析结果显示，HIF-1α与P-gp表达呈正相关(r=0.574，P<0.01)，说明HIF-1α与P-gp共同参与了结肠癌的生长、转移，可能存在一定的相互作用关系[18]。
综上所述，HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中存在过表达和共表达现象，在不同Dukes分期和是否伴随淋巴结转移等因素中二者阳性表达率有明显差异，且二者表达呈明显正相关；低氧可以诱导结肠癌细胞中HIF-1α与P-gp蛋白水平表达升高，HIF-1α可能通过与P-gp直接或间接地相互作用而参与结肠癌的发生。
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Expressions of HIF-1α and P-gp in colon carcinoma tissues and cell lines under hypoxic conditions
YangGuanglei1，HuYanfang2，ZhaoShan3，GeGuoqing1，HuYanwei1，HuoCaijuan1，PengLintao1
(1.DepartmentofGeneralSurgery,XingtaiPeople′sHospital,Xingtai,Hebei054031,China；2.DepartmentofNeurology,XingtaiPeople′sHospital,Xingtai,Hebei054031；3.DepartmentofOncology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)
Objective To investigate the effects of hypoxic conditions on expressions of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and P-glycoprotein (P-gp),and the relationship between HIF-1α and P-gp.Methods Tumor tissues from 54 cases of patients with colonic neoplasm in Xingtai People′s Hospital were selected after operation from June 2013 to June 2015.The expressions of HIF-1α and P-gp in colonic tumor tissues were detected by using immunohistochemistry,and their correlations to clinical and pathologic features were analysed.The expressions of HIF-1α and P-gp in colonic tumor cell lines under normoxia and hypoxia conditions were detected by using cell smear method,and correlation between HIF-1α expression and P-gp expression was analysed.Results Among tumor tissues from 58 cases of patients with colonic neoplasm,the positive rate of HIF-1α expression was 58.62%,and that of P-gp expression was 46.55%.The positive rates of HIF-1α and P-gp expressions of patients on the Dukes stage C+D were significantly higher than those of patients on A+B phase (P<0.05).Additionally,the positive rates of HIF-1α and P-gp expressions of patients with lymphatic metastasis were significantly higher than those of patients without lymphatic metastasis (P<0.05).The HIF-1α expression was positively correlated with the P-gp expression (r=0.574，P<0.01).For the same cell lines,the expression levels of HIF-1α and P-gp under hypoxia condition were significantly higher than those under normoxia condition,there were statistically significant differences (P<0.01).While,under the same oxygen conditions,no statistically significant difference was found in expression levels of HIF-1 and P-gp among different colonic tumor cell lines (P>0.05).Conclusion Overexpression and coexpression of HIF-1α and P-gp exist in colon cancer.The expression levels of HIF-1α and P-gp in patients with different Dukes stages and patients with or without lymph node metastasis are significantly different,and positive correlation is observed between the expression of HIF-1α and P-gp.Hypoxia condition can induce an increase in expressions of HIF-1α and P-gp in colonic tumor cells.
hypoxia-inducible factor 1α；P-glycoprotein；colonic neoplasms
2016年度重庆市出版专项资金资助项目
杨光磊(1982-)，主治医师，硕士，主要从事结肠癌化疗耐药和抗凋亡机制方面的研究。
��·临床研究
10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.020
R735.4
A
1671-8348(2017)19-2659-03
2017-02-19
2017-04-24)
