补肾活血排毒法组方中药对慢性肾脏病大鼠肾脏细胞凋亡的影响*

黎 颖，唐 佳，熊维建，宋 娜，赖宗浪，周 鑫，钟 锦△

(重庆市中医院：1.肾病科；2.肿瘤科；3.内分泌科 400021)

论着·基础研究

补肾活血排毒法组方中药对慢性肾脏病大鼠肾脏细胞凋亡的影响*

黎 颖1，唐 佳1，熊维建1，宋 娜2，赖宗浪2，周 鑫3，钟 锦1△

(重庆市中医院：1.肾病科；2.肿瘤科；3.内分泌科 400021)

目的观察补肾活血排毒法组方中药对慢性肾脏病大鼠的治疗作用及细胞凋亡的影响。方法采用单侧输尿管梗阻(UUO)动物模型，将SD雄性大鼠分为假手术组、UUO模型组、补肾活血排毒法中药低剂量治疗组和高剂量治疗组，自动生化分析仪检测肾功能；苏木素-伊红(HE)染色检测肾脏组织病理损伤；TUNEL法检测肾组织细胞凋亡；Western blot法检测B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平。结果与UUO模型组相比，补肾活血排毒法中药各剂量组血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)均明显下降(P<0.05)。病理观察，模型组可见肾小管上皮细胞凋亡、坏死、脱落，炎性细胞浸润，补肾活血排毒法中药各剂量组均较UUO模型组肾损伤程度轻(P<0.05)。TUNEL法检测UUO模型组细胞凋亡数较假手术组明显增多，补肾活血排毒法中药各剂量组可显着减少细胞凋亡数目(P<0.05)。与UUO模型组相较，补肾活血排毒法中药各剂量治疗组Bcl-2水平明显上调，Bax 水平下调，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。以上结果均呈剂量依赖性。结论补肾活血排毒法中药能明显下调血清肌酐和尿素氮水平，抑制UUO大鼠肾脏细胞凋亡，调节Bcl-2、Bax水平。

慢性肾脏病；中药疗法；细胞凋亡；补肾活血排毒法组方中药；Bcl-2/Bax

慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)是由各种原因造成的肾单位严重受损，肾小球滤过率进行性下降，机体排泄代谢废物和调节水电解质、酸碱平衡紊乱的临床综合征[1]。现代医学对CKD的有效治疗主要为血液透析和肾移植等，但其均不能用于治疗早中期CKD，且费用昂贵，已成为患者家庭的沉重负担。因此，如何延缓CKD病程的进展，已成为医学界面临的重大课程。补肾活血排毒法组方中药是本院国医大师郑新教授治疗CKD患者的经验方，在多年临床治疗中取得满意疗效。为进一步探讨其作用机制，本实验观察补肾活血排毒法组方中药对单侧输尿管梗阻(UUO)所致CKD大鼠肾脏细胞凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物选用健康SD雄性大鼠，5～7周龄，体质量220～280 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。补肾活血排毒法组方中药：黄芪、红参、大黄、淫羊藿、川芎、杜仲等，均购自重庆市中医院中药房，经煎煮、过滤、水浴蒸发分别浓缩至2.0 g·kg-1·d-1和4.0 g·kg-1·d-1，置于冰箱保存。主要试剂为TUNEL检测细胞凋亡试剂盒购自美国Sigma公司，兔抗大鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

表1 治疗前与治疗后各组BUN、Scr变化比较

a：P<0.05,与假手术组比较；b：P<0.05,与UUO模型组比较；c:P<0.05，与治疗前比较；d:P<0.05，与低剂量组比较

1.2方法

1.2.1动物模型的建立与分组 UUO动物模型的建立：大鼠经10%水合氯醛麻醉后，采用左侧背部切开腹腔，钝性分离左侧输尿管，于输尿管中上1/3 处以4-0线双重结扎后切断输尿管，分层缝合关闭腹腔。48只大鼠分4组：(1)假手术组；(2)UUO模型组；(3)补肾活血排毒法中药低剂量组(简称低剂量组)；(4)补肾活血排毒法中药高剂量组(简称高剂量组)。假手术组只找到输尿管，不结扎，常规喂养。各组大鼠分别于术后第14天时分批(12只)处死，留取大鼠血液标本及左侧肾脏。

1.2.2给药方法 于手术后第1天开始灌胃给药治疗，补肾活血排毒法组方中药治疗组分别予高剂量(4.0 g·kg-1·d-1)和低剂量(2.0 g·kg-1·d-1)灌胃，UUO模型组予等量0.9%生理盐水，每天1次,连续14 d,实验过程中大鼠自由进食、饮水，室温控制在20～24 ℃，通风湿度良好。

1.2.3生化分析仪检测肾功能 治疗前取尾静脉血，治疗后断头取血，采血前禁食8 h。血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)用生化分析仪测定。

1.2.4组织病理学检查 取经4%多聚甲醛溶液固定24 h的肾脏组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4 μm的石蜡切片，按常规方法进行苏木精-伊红(HE)染色。

1.2.5Western blot法检测目的蛋白 Western blot分析肾脏组织Bcl-2、Bax的表达。用总蛋白裂解液提取肾脏总蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白质浓度，每泳道上样40 μg 蛋白，电泳、转膜后，5%牛血清清蛋白TBST溶液室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后再以辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育；洗膜，加电化学发光(ECL)发光液，Fujifilm化学发光成像系统拍照。Image Pro Plus 6.0 分析各条带的累积光密度值，将各目的条带与同一泳道内参照β-actin 的累积光密度值的比值作为该泳道中目的蛋白表达的半定量结果。

1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡 石蜡切片厚4 μm，常规脱蜡入水。3%H2O2室温处理10 min,加1∶100 TBS新鲜稀释的蛋白酶K 37 ℃消化10 min。洗涤后加脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)和地高辛标记的脱氧核苷(Dig-dUTP),置湿盒中4 ℃过夜。洗涤，加封闭液室温30 min，加1∶100封闭液稀释的生物素化抗地高辛抗体，37 ℃ 30 min，加链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒37 ℃ 30 min，充分水洗后二氨基联苯胺(DAB)显色，光镜观察。

2 结 果

2.1各组大鼠肾功能比较 UUO模型组大鼠的BUN、Scr在术后明显上升(P<0.05)；术后，高剂量组和低剂量组的BUN和Scr较UUO模型组明显下降(P<0.05)，其中高剂量组组较低剂量治疗组肾功能改善更明显(P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠肾脏病变比较 HE染色显示，光镜下假手术组大鼠肾小管基底膜完整，小管上皮细胞结构清晰，未见变性坏死，腔内未见管型。UUO模型组大鼠在皮质区及外髓质区可以见到典型的肾小管坏死，包括肾小管上皮细胞凋亡(RTECs)严重变性、崩解和脱落，肾小管管腔扩张，肾间质水肿及炎症细胞浸润。而高、低剂量组的肾组织损伤程度较UUO模型组有所减轻，高剂量组较低剂量组病理改善更明显。半定量评分显示高、低剂量组的肾损伤程度明显低于UUO模型组(P<0.05)，高剂量组较低剂量组肾损伤程度轻(P<0.05)，见图1。

A:假手术组;B:UUO模型组;C:低剂量组;D：高剂量组；E：半定量分析图

图1各组大鼠肾脏病变比较(HE，×400)

2.3各组大鼠肾脏凋亡比较 假手术组肾组织中仅见到极其少量的TUNEL阳性细胞；UUO模型组大鼠见到大量TUNEL阳性细胞，主要分布在肾脏的皮质区和外髓质区；高、低剂量组的TUNEL细胞凋亡数均较UUO模型组减少，高剂量组的TUNEL细胞凋亡数较低剂量组明显减少(P<0.05)，见图2。

2.4各组大鼠肾脏Bcl-2、Bax水平比较 UUO模型组肾组织中Bcl-2、Bax水平较假手术组明显升高，但Bcl-2/Bax比值下降。高、低剂量组肾脏Bcl-2水平较UUO模型组明显升高，但Bax水平明显下降，Bcl-2/Bax比值高于假手术组和UUO模型组(P<0.05)，高剂量组Bcl/Bax比值较低剂量组更高(P<0.05)，见图3。

A:假手术组;B:UUO模型组;C:低剂量组;D：高剂量组;E:定量分析图

图2各组慢性肾衰竭大鼠肾脏凋亡比较(TUNEL,×400)

A:大鼠肾脏组织Bcl-2蛋白水平比较;B:大鼠肾脏组织Bax蛋白水平比较;C：Bcl-2/Bax比值强度比较

图3各组Bcl-2和Bax水平比较

3 讨 论

CKD属于中医“水肿”“溺毒”“关格”“虚劳”等范畴。祖国医学认识CKD病因病机多为脏腑虚损，又因外邪侵袭，情志所伤，劳累过度而使病情加重，最后导致正虚邪实[2-3]。本院国医大师郑新教授认为正虚与浊毒、久病而瘀是本病的中心环节，其研制的以扶正祛邪法为大法的补肾活血排毒法组方中药，具有补肾活血、排毒降浊的功效，可改善肾虚血瘀的病理变化，使机体阴阳平衡，扶正祛邪[4]。本课题组前期临床研究发现，补肾活血排毒法组方中药可显着降低患者血中SCr、BUN的水平，以改善CKD患者脘腹胀满、食少纳呆、恶心呕吐、大便秘结不通等症状，延缓CKD患者的病程进展[5]，但其具体作用机制，尚不清楚。

现代医学研究证实RTECs是CKD重要的发病机制之一[6-8]。CKD患者肾脏局部炎症因子过度表达，肾素-血管紧张系统(RAS)激活，氧化应激反应等导致RTECs线粒体损伤，线粒体膜通透性改变，凋亡蛋白包括细胞色素-C(Cyt-C)、激活胱天蛋白酶(Caspase)蛋白酶、细胞凋亡诱导因子(AIF)等从线粒体到胞质，导致RTECs凋亡[9-11]。因此，抑制RTECs的凋亡，改善肾小管间质的损伤，是延缓CKD进展的重要干预环节。在本实验研究发现，单侧切断大鼠输尿管14 d，存在着肾小管间质明显损伤、RTECs凋亡，并且与肾小管坏死甚至结构消失相平行。RTECs大鼠经补肾活血排毒法中药治疗后，RTECs凋亡明显减少，肾脏病理损害和功能异常明显得到改善，提示可以通过补肾活血排毒法组法中药治疗抑制RTECs凋亡而发挥肾脏保护作用。

大量研究进一步证实线粒体/Cyt-C信号通路是激活 Caspase执行细胞凋亡的重要途径。Bcl-2家族对该途径有重要的调控作用，其中Bcl-2/Bax比率调控着线粒体膜是否受损及细胞是否发生凋亡。线粒体膜受损后释放Cyt-C，Cyt-C与细胞凋亡因子Apaf1形成复合物激活Caspase-9，进而级联激活Caspase-3，导致细胞凋亡[12-13]。大鼠造模14 d后，Bcl-2与Bax的表达均明显升高，但Bax升高更明显，故Bcl-2/Bax比值降低，细胞凋亡增加，这与其他学者的研究报道相一致[14-15]；给予UUO大鼠补肾活血排毒法组方中药治疗后，Bcl-2、Bcl/Bax水平明显升高，而Bax的表达则明显下降，并呈剂量依赖，提示补肾活血排毒法中药可能通过促进Bcl-2的表达、抑制Bax的表达，发挥抗凋亡作用。

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Effectofnourishingkidney,activatingbloodandexpellingtoxinmethodChinesemedicineonrenalcellsapoptosisinCKDrats*

LiYing1,TangJia1,XiongWeijian1,SongNa2,LaiZonglang2,ZhouXin3,ZhongJin1△

(1.DepartmentofNephrology;2.DepartmentofOncology;3DepartmentofEndocrinology,ChongqingMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China)

ObjectiveTo observe the curative effect of nourishing kidney,activating blood and expelling toxin method Chinese medicine on chronic kidney disease (CKD) rats and influence on cellular apoptosis.MethodsThe UUO animal model was adopted.SD male rats were divided into the sham operation group,UUO model group,Chinese medicine low dose group and high dose group.The renal function was measured by the automatic biochemical analyzer,the renal histopathologic change was observed by HE staining,the renal tissue apoptosis rate was observed by TUNEL as well as the protein expression levels of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot.ResultsCompared with the UUO model group,the levels of serum creatinine(Scr) and urea nitrogen(BUN) in Chinese medicine various doses groups were significantly decreased(P<0.05).In the UUO pathologic observation,renal tubular epithelial cells apoptosis,necrosis,exfoliation,inflammatory cells infiltration were found in the model group,the renal damage in the Chinese medicine various doses groups were slighter compared with the UUO group(P<0.05).The TUNEL method detection showed that the cellular apoptosis number in the UUO group was significantly increased compared with the sham operation group,the Chinese medicine various doses groups could significantly decrease the apoptosis number(P<0.05).Compared with the UUO model group,the level of Bcl-2 in the Chinese medicine treatment groups was markedly up-regulated,the Bax level was down-regulated,and the ratio of Bcl-2/Bax was increased(P<0.05).Above results all showed the dose dependent manner.ConclusionThe nourishing kidney,activating blood and expelling toxin method Chinese medicine can obviously down-regulate serum Scr and BUN levels,inhibits the renal cells apoptosis in UUO rat and regulates the Bcl-2 and Bax levels.

chronic kidney disease；drug therapy；apoptosis；the chinese herbs with the function of activating the blood and removing the blood stasis;Bcl-2/Bax

R-33

A

1671-8348(2017)26-3611-03

2017-02-22

2017-06-06)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.004

重庆市基础科学与前沿技术研究项目(cstc2017jcyjAX0465)。

黎颖(1983-)，主治医师，博士，主要从事慢性肾脏病方面研究。△

，E-mail:120852723@qq.com。