韦斯军，黄干荣，曾海生，周歧骥，莫昕莹,徐灵源，廖作庄

(1.右江民族医学院附属医院药剂科，广西百色 533000；2.右江民族医学院桂西地区微生物感染研究重点实验室培育基地，广西百色 533000)

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的病理结构改变，其实质是在各种致病因素的作用下，肝脏星状细胞合成的细胞外基质明显增加，超出了肝脏自身的降解能力[1-2]。四氯化碳(CCl4)是一种十分经典的肝纤维化造模毒物，大量应用于基础研究[3]。有研究从体内证实维生素D能降低肝脏纤维化，从体外实验证实维生素D能减少肝脏星状细胞胶原纤维的分泌[4]。也有文献报道葛根素能改善肝纤维化，其可能与下调TNF-α信号通路降低肝星状细胞活化有关[5-6]。可见，维生素D与葛根素单独使用具有抑制纤维化的效果，其作用机制有一定的交叉重叠，均与抑制肝星状细胞的活化及其胶原纤维的分泌有关。但二者联合是否能增强抗肝纤维化的作用未有报道，因此本研究用CCl4肝纤维化大鼠模型，探讨维生素D联合葛根素对肝纤维化的作用效果及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级健康雄性Wistar大鼠50只，周龄相近，体质量200 g左右，由右江民族医学院动物中心提供。CCl4为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。维生素D与葛根素购于Sigma公司，玉米油购于和光纯药工业株式会社，天狼星红染色液购于北京雷根生物技术有限公司，实时荧光定量PCR试剂盒购于瑞士Roche公司，核因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子(TNF-α)抗体购于美国Santa cruze公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。

1.2方法 将Wistar大鼠50只分为5组。CCl4组，按照3 mL/kg的比例腹腔注射45% CCl4玉米油溶液，每周2次；正常对照组(C组)，给予等量的生理盐水，腹腔注射，每周2次；维生素D组(V组)、葛根素组(P组)及维生素D联合葛根素组(V+P组)为相应药物干预组，在CCl4玉米油溶液造模基础上分别按照维生素D 2.0 μg/kg、葛根素0.4 g/kg、维生素D 2.0 μg/kg与葛根素0.4 g/kg的比例灌胃，每周2次。每次灌喂之前禁食1 h，C组在实验中灌胃等量生理盐水。共8周，在实验结束的前1晚禁食过夜。第2天处死大鼠，取全血，室温静置20 min，以5 000 r/min离心15 min，取上清液，得到血清，用试剂盒检测血中透明质酸(HA)。取大鼠肝脏，用试剂盒检测肝脏中的羟脯氨酸(Hyp)。一部分肝脏用多聚甲醛溶液固定，常规制备石蜡切片，进行天狼星红染色，显微镜下观察肝脏组织切片的病理变化及纤维化的严重程度。通过实时荧光定量PCR检测胶原蛋白(Collagen) Ⅰ、Ⅲ mRNA及Western blot检测NF-KB和TNF-α蛋白水平。

表1 引物名称及序列

F:正向引物;R:反向引物

2 结 果

2.1血和肝生化指标的测定结果 HA是分布于肝细胞周围的一种蛋白多糖，肝纤维化时血中水平明显增加[7]。肝脏中的Hyp是肝脏胶原纤维的重要组成部分，纤维化发生时肝脏中水平也明显增加[8]。因此这两者是肝纤维的重要诊断指标。CCl4组的HA和Hyp均明显高于C组，一定程度上表明肝纤维化模型建立成功。V组、P组及V+P组的HA和Hyp水平相对于CCl4组明显降低，而且V+P组降低得最为明显，见表2。

表2 血液与肝脏生化指标

a:P<0.05，与C组比较；b:P<0.05，与CCl4组比较组；c：P<0.05，与V组比较；d：P<0.05，与P组比较；e：P<0.05，与V+P组比较

2.2肝脏组织病理切片观察结果 大鼠肝组织纤维化面积CCl4组最大，C组最小(P<0.05)，各给药组中V+P组纤维化面积最小，见图1。

A:C组；B:CCl4组；C:V组；D：P组；E:V+P组；F:天狼星红染色阳性面积统计图；a:P<0.05，与C组比较；b:P<0.05，与CCl4组比较组；c：P<0.05，与V组比较；d：P<0.05，与P组比较；e：P<0.05，与V+P组比较

图1 天狼星红染色切片(×200)

续表3 肝脏Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平

a:P<0.05，与C组比较；b:P<0.05，与CCl4组比较组；c：P<0.05，与V组比较；d：P<0.05，与P组比较；e：P<0.05，与V+P组比较

2.3肝脏Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平 大鼠肝脏Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平，CCl4组最高，C组最低(P<0.05)，各给药组中V+P组Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平最低，见表3。

2.4肝脏TNF-α与NF-κB蛋白水平 大鼠肝脏TNF-α与NF-κB蛋白水平，CCl4组最高，C组最低(P<0.05)，各给药组中V+P组NF-κB蛋白水平最低，P组与V+P组TNF-α比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

A:Western blot检测肝脏TNF-α与NF-NF-κB蛋白水平；B:TNF-α灰度分析；C:NF-κB灰度分析。a:P<0.05，与C组比较；b:P<0.05，与CCl4组比较组；c：P<0.05，与V组比较；d：P<0.05，与P组比较；e：P<0.05，与V+P组比较

图2肝脏TNF-α与NF-κB蛋白水平比较

3 讨 论

肝纤维化是慢性肝疾病在进程中不可避免的病理改变，若不阻断其进程，进一步发展就会演变为肝硬化。肝纤维化的致病因素十分多样，如病毒、寄生虫、酒精及其他一些毒物包括CCl4。其实质可以归纳为肝实质细胞外的细胞外基质的生成与降解的平衡紊乱，这些细胞外基质在肝脏内不断积聚，其中最主要的成分就是胶原纤维[9]。而肝星状细胞是细胞外基质生成与降解的主要参与者，因此其活化是肝纤维化发生的中心环节。

维生素D大部分通过肝脏合成，而且肝脏本身也是其作用的靶器官之一。文献报道维生素D可以改善CCl4导致的大鼠纤维化，而且离体实验表明可能与其降低肝星状细胞活化与胶原纤维分泌减少有关。葛根素作为一种被大量应用于临床的黄酮类药物，有研究表明其也能降低CCl4导致的肝纤维化，其中NF-κB/TNF-α信号通路是被抑制的，但葛根素与维生素D联用后该信号通路是否也被明显抑制未见报道。由于大量文献报道氧化应激与肝纤维化密切相关，且NF-κB/TNF-α信号通路在肝星状细胞活化中起着十分重要的作用[10]，所以，无论是单用维生素D还是葛根素，在肝纤维化过程中保护肝脏都与抑制肝星状细胞的功能密切相关，这提示二者联用可能会发挥更大保护作用。

维生素D和葛根素均能明显降低大鼠HA及肝脏中的Hyp水平，使得大鼠肝脏胶原纤维明显降低。维生素D联合葛根素对各种损伤指标的降低及胶原纤维沉积的改善最为明显，从而证实了二者有协同作用，联用对肝纤维化的保护作用更明显。

肝脏纤维化的实质是肝脏细胞外基质的生成增加而降解减少。细胞外基质的主要成分是胶原纤维，而 Collagen Ⅰ、Ⅲ是胶原纤维的主要存在形式，大部分是由肝星状细胞合成[11]。在肝纤维化的进程中，NF-κB和TNF-α是重要的信号分子。TNF-α介导下游NF-κB的激活，而NF-κB在肝星状细胞的活化过程中发挥极其重要的作用[12]。维生素D和葛根素均能降低这些分子的mRNA及蛋白水平，维生素D联合葛根素的降低作用同样最为明显。以上研究提示维生素D联合葛根素在肝纤维化过程的保护作用是降低肝星状细胞的活化及其胶原纤维的分泌。

本项研究探讨了维生素D联合葛根素对CCl4诱导的大鼠纤维化的保护作用，其联合用药比单独用药抗肝纤维化效果更好，并初步探究了其机制与Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA及NF-κB和TNF-α的蛋白水平增加有关，这对临床实践有一定的参考价值。但调控途径往往由多因子、多路径参与，其作用机制还有待进一步探究。

[1]马志刚，陈兰，詹灵凌，等．Wnt信号通路调控肝星状细胞活化及增殖在肝纤维化治疗中的研究进展[J]．世界华人消化杂志，2014，22(21)：3048-3055．

[2]FRIEDMAN S L.Molecular regulation of hepatic fibrosis,an integrated cellular response to tissue injury[J].J Biol Chem,2000,275(4):2247-2250.

[3]魏晓光，郭辉，陈永珍，等．腹腔注射CCl4建立大鼠肝纤维化模型[J]．实验室研究与探索，2015，34(11)：34-37．

[4]ABRAMOVITCH S,DAHAN-BACHAR L,SHARVIT E A,et al.Vitamin D inhibits proliferation and profibrotic marker expression in hepatic stellate cells and decreases thioacetamide-induced liver fibrosis in rats[J].Gut,2011,60(12):1728-1737.

[5]LI R,XU L Y,LIANG T,et al.Puerarin mediates hepatoprotection against CCl4-induced hepatic fibrosis rats through attenuation of inflammation response and amelioration of metabolic function[J].Food Chem Toxicol,2013,52(2):69-75.

[6]KAJI K,YOSHIJI H,IKENAKA Y,et al.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor attenuates hepatic fibrosis via suppression of activated hepatic stellate cell in rats[J].J Gastroenterol,2014,49(3):481-491.

[7]肖蕾，王云莲，艾力江·吐尔逊，等．血清透明质酸、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白与大鼠放射性肝纤维化的相关性研究[J]．中华全科医学，2015，13(1)：18-20．

[8]王者令，刘中景，宋霆，等．扶正活血不同组方对肝纤维化大鼠相关血清指标及肝组织羟脯氨酸的影响[J]．中药新药与临床药理，2010，21(6)：611-613．

[9]LU J,CHEN B A,LI S L,et al.Tryptase inhibitor APC 366 prevents hepatic fibrosis by inhibiting collagen synthesis induced by tryptase/protease-activated receptor 2 interactions in hepatic stellate cells[J].Int Immunopharmacol,2014,20(2):352-357.

[10]WANG Y,ZHAO Z,YAN Y,et al.Demethyleneberberine protects against hepatic fibrosis in mice by modulating NF-κB signaling[J].Int J Mol Sci,2016,17(7):1036.

[11]FRIEDMAN S L,BANSAL M B.Reversal of hepatic fibrosis:fact or fantasy?[J].Hepatology,2006,43(1):82-88.

[12]赵宗豪，梅俏，吴军，等．核转录因子-κB与大鼠肝纤维化关系的实验研究[J]．安徽医学，2003，24(5)：1-3．