杜海林，杨绍兵，丛广志，王 凯，贾绍斌△

(1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院心脏中心，银川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是体内一种含硫氨基酸，近年相关研究表明，Hcy通过多种机制导致疾病的发生，并将其列为心血管疾病重要的独立危险因素[1]。在Hcy致心血管疾病的众多机制中，内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)作为近年来研究损伤与凋亡的热点而备受关注[2]。内质网是细胞内调节蛋白质合成和折叠的细胞器，体内外诸多因素导致错误折叠蛋白和未折叠蛋白集聚在内质网称ERS。在未发生应激时，内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated-protein，GRP78)与胰腺内质网激酶(pancreatic-ER-kinase,PERK)、肌醇必须酶-1(inositol requiring RNAse-1，IRE1)及转录激活因子-6(activating-transcription factor-6，ATF-6)紧密结合在一起，抑制后三者激活[3]。在应激状态下，PERK、IRE1、ATF-6和GRP78解离，进而结合未折叠蛋白，启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，阻止未折叠蛋白堆积而发挥细胞保护作用。但长时间ERS，PERK磷酸化为磷酸化PERK(p-PERK),后者激活下游的CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)及CHOP下游靶点内质网氧化还原酶1α(endoplasmic reticulum oxidoreductin-1α，ERO1α)，启动凋亡程序[4]。有研究发现，慢性心力衰竭(CHF)患者血清Hcy水平较无心力衰竭患者增高，提示除缺血因素外，Hcy是导致CHF的又一独立危险因素，但其机制仍不清楚[5]。目前Hcy通过ERS促进动脉斑块形成的报道较多，而Hcy对心肌的影响鲜见报道。本研究旨在探讨Hcy是否通过ERS导致心肌细胞损伤，其损伤是否和 CHOP-ERO1α通路激活所介导的凋亡有关，以为临床干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 H9C2心肌细胞由中乔新舟提供；Dulbecco′s 改良培养基(DMEM)及胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，4-苯基丁酸( 4-phenylbutyric acid，4-PBA)及Hcy购自Sigma公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)制备试剂盒购自康为世纪公司；抗GAPDH单抗及抗β-actin单抗购自中杉金桥公司；ER-Stress抗体试剂盒购自Cell Signaling Technology；Anti-ERO1α抗体购自Abcam公司；FITC标记山羊抗兔荧光二抗购自中杉金桥公司；全蛋白提取试剂盒及BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自凯基生物公司；CCK-8细胞毒力检测试剂盒购自上海合元生物公司；罗氏TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche公司；酶标仪由Thermo公司提供。

1.2方法

1.2.1CCK-8检测Hcy及4-PBA对细胞损伤 将H9C2细胞于含10%FBS的DMEM(普通培养基)中培养，待细胞生长至对数期时用于实验：(1)将细胞重悬后接种于96孔板用于CCK-8检测，密度为1×103个/孔，并将其分为对照组(H0)及H组，培养24 h使其贴壁，对照组给予普通培养基培养，H组分别在上述普通培养基中加入终浓度为50、100、400、1 000 μmol/L的Hcy(分别为H50、H100、H400、H1000)，每组10个复孔。培养72 h后更换无血清DMEM，并向每孔中加入CCK-8检测试剂10 μL。同时设置空白对照组：仅加入无血清培养基及CCK-8检测试剂。继续培养2 h后酶标仪检测OD值。(2)取上述对数生长期细胞检测4-PBA对细胞存活率的影响：将细胞分为对照组(P0)和P组，对照组给予普通培养基培养，P组分别在上述普通养基中加入终浓度为1、2、3、4、5 mmol/L的4-PBA(分别为P1、P2、P3、P4、P5)，其余实验步骤同上,检测出2 mmol/L的4-PBA对细胞无损伤作用，并将此浓度用于后续实验。(3) 取对数生长的H9C2细胞，分为H组和HP2组，H组按上述(1)步骤加入不同浓度Hcy(分别为H50、H100、H400、H1000)。HP2组除按(1)步骤加入Hcy外，每组另加终浓度为2 mmol/L的4-PBA(分别为H50P2、H100P2、H400P2、H1000P2)，其余操作同前。经过72 h干预，使用酶标仪检测96孔板OD值，通过OD值计算每孔细胞存活率。细胞存活率=(A干预-A空白)/(A对照-A空白) ×100%。A干预指含有细胞、CCK-8溶液和干预试剂孔的OD值；A空白指含有培养基和CCK-8溶液而没有细胞孔的OD值；A对照指含有细胞、CCK溶液而无药物溶液孔的OD值。

1.2.2TUNEL凋亡染色 经过CCK-8检测，根据细胞半数抑制率及存活率选择400 μmol/L的Hcy及2 mmol/L的4-PBA作为最适浓度，用于后续实验。预先在24孔板中放入细胞爬片，向孔内接种对数生长期H9C2细胞，密度为1×104个/孔，并将其分为对照组、H400组、H400P2组，贴壁24 h后,对照组给予普通培养基培养，H400组给予含Hcy终浓度为400 μmol/L上述普通培养基培养，H400P2组在H400组基础上加入终浓度为2 mmol/L的4-PBA。培养72 h后取出爬片，按罗氏TUNEL凋亡染色试剂盒说明进行操作，荧光显微镜下观察并计数视野下细胞总数及凋亡细胞数，每组计数10个视野用于统计学分析。

1.2.3免疫荧光检测ERO1α表达 预先在24孔板中放入细胞爬片，向孔内接种对数生长期H9C2细胞，密度为 5×103个/孔，并将其分为对照组、H400组、H400P2组，贴壁24 h后,对照组给予普通培养基培养，H400组给予含Hcy终浓度为400 μmol/L上述普通培养基培养，H400P2组在H400组基础上加入终浓度为2 mmol/L的4-PBA。培养72 h后取出爬片，4%多聚甲醛固定，3%过氧化氢作内源性过氧化物酶处理，1%Triton-X100通透，山羊血清封闭，加入抗ERO1α单抗(1∶200)于4 ℃过夜，次日PBS清洗后加入FITC标记山羊抗兔荧光二抗(1∶100)，DAPI显色，荧光显微镜下观察细胞质红染的阳性细胞，并计数每个视野下阳性细胞数占该视野下细胞总数百分数，每组计数10个视野用于统计学分析。

1.2.4Western blot检测PERK/p-PERK/CHOP/ERO1α表达 取对数生长期H9C2细胞，重悬后将其接种于6孔板，密度为5×104个/孔，并将其分为对照组、P2组、H400组、H400P2组。贴壁24 h后，对照组给予普通培养基培养；P2组给予含4-PBA终浓度为2 mmol/L的上述普通培养基培养；H400组给予含Hcy终浓度为400 μmol/L的上述普通培养基培养；H400P2组在H400组基础上加入终浓度为2 mmol/L的4-PBA。培养72 h后使用全蛋白提取试剂盒提取各组细胞全蛋白，使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，以10%SDS-PAGE电泳转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，室温下脱脂牛奶封闭 90 min，加入相应一抗：PERK(1∶1 000)、p-PERK(1∶1 000)、 CHOP(1∶1 000)、ERO1α(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)于4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。ClinxChemiScope6300化学发光成像系统自动曝光，并使用系统配套软件分析条带灰度值。以GAPDH或β-actin作为内参,重复实验3次，将3次实验结果所测得的灰度值作统计学分析。

2 结 果

2.1Hcy及4-PBA对细胞损伤 经不同浓度Hcy干预72 h后，细胞存活率明显降低，且随Hcy浓度增加存活率呈下降趋势，与对照组比较差异有统计学意义(F=2 039.580,P<0.01)，见图1A。当Hcy浓度为400 μmol/L时，细胞存活率接近半数抑制率，故选用Hcy浓度为400 μmol/L完成后续实验。4-PBA为3 mmol/L时，可见明显损伤作用。而4-PBA为2 mmol/L时，对H9C2心肌细胞无明显损伤作用，与对照组比较差异无统计学意义(t=0.245,P=0.823)，见图1B，故选用2 mmol/L的4-PBA作为后续实验浓度。Hcy浓度为50 μmol/L时，是否加入4-PBA，细胞存活率差异无统计学意义(t=0.320,P=0.755)，见图1C。随着Hcy浓度增大，HP2组细胞存活率较同浓度H组明显增加，差异均有统计学意义(t=13.161、29.255、52.474，P<0.01)。

A:Hcy干预后细胞存活率；B:4-PBA干预后细胞存活率；C:相同Hcy浓度下H组与HP2组细胞存活率比较；a：P<0.01，与H组比较

图1不同浓度Hcy及4-PBA干预后的细胞存活率

A:上图为视野下所有细胞，下图为凋亡细胞(×400)；B：不同组凋亡平均百分数比较;a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.01，与H400组比较

图2 TUNEL细胞凋亡染色检测

A:上图为视野下细胞总数，下图为阳性细胞(×400)；B：各组ERO1α表达阳性细胞平均百分数；a：P<0.01，与对照组比较;b:P<0.01，与H400组比较

图3免疫荧光染色检测ERO1α表达

a:P<0.01,与示H400组比较；bP<0.01，与H400P2组比较

图4各组PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表达在各组中的条带灰度值

2.2TUNEL凋亡染色 H400组经400 μmol/L的Hcy干预后，与对照组比较，凋亡细胞分数明显增加(t=21.593,P<0.01)；H400P2组由于培养基中含有2 mmol/L的4-PBA,与H400组比较，细胞凋亡分数明显减少(t=8.742,P<0.01)，见图2A、B。

2.3免疫荧光检测ERO1α表达 与对照组比较，H400组细胞质ERO1α表达明显增加，差异有统计学意义(t=19.205,P<0.01)；而同时经Hcy及4-PBA干预的H400P2组，ERO1α表达与H400组比较明显减低，差异有统计学意义(t=9.908,P<0.01)，见图3A、B。

2.4Western blot检测PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表达 H9C2心肌细胞经400 μmol/L的Hcy干预后，ERS相关蛋白PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表达均有所增加，与对照组比较，各因子表达均差异有统计学意义(t=70.326、15.973、69.353、39.019,P<0.01)。与H400组比较，H400P2组PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表达均有所下降(t=40.766、9.540、30.390、12.587,P<0.01)，见图4。

3 讨 论

Hcy作为体内蛋氨酸脱甲基代谢的一种中间产物，具有细胞毒性。当前的一些研究证实其毒性作用可致全身多种疾病，包括2型糖尿病、肿瘤、肾脏疾病及动脉粥样硬化等[6-7]。本研究第一次观察到Hcy对心肌细胞的直接损伤作用，并通过细胞模型探讨了损伤的机制，对临床高同型半胱氨酸血症(HHcy)的干预提供了理论依据。

HHcy(≥10 μml/L)是WHO近年公布的致心血管疾病新的危险因素[8]。关于Hcy致心血管疾病的机制，较为明确的有：(1)Hcy诱发氧化应激反应[9]；(2)诱导平滑肌细胞增殖等导致动脉粥样硬化[10]；(3)诱导生长抑制因子和DNA损伤诱导因子(GADD34)及T细胞死亡基因51(TDAG51)表达,触发ERS反应[11]。本课题组首先通过CCK-8试剂盒检测到了Hcy对心肌细胞损伤，同时通过TUNEL染色，证实了Hcy致心肌损伤的机制是通过促进细胞凋亡所致，最后采用免疫荧光及Western blot等手段，观察到了经Hcy干预后，ERS通路中，凋亡调节蛋白的表达增加，清楚地阐明了Hcy通过ERS致心肌凋亡的一条通路。首次发现了Hcy通过ERS机制，直接导致心肌损伤。

Hcy是人体蛋氨酸代谢的产物，体内叶酸和维生素B12缺乏都将导致血清Hcy积聚[12]。故目前对HHcy的预防主要是补充维生素B12和叶酸[13]。但近来一些临床相关的Meta分析显示，人为的补充VB12和叶酸并不能降低临床发生心血管事件的风险[14]。因此需要探索新的手段对临床高Hcy进行干预，本实验结果显示，在含有Hcy的培养基中加入4-PBA，细胞损伤明显减轻，TUNEL染色也提示相应凋亡细胞比例减少，Western blot也显示，4-PBA干预后的心肌细胞内质网通路相关蛋白PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表达均有所下降，而CHOP及ERO1α被认为是细胞凋亡的起始因子，此二者表达增加提示Hcy可以经凋亡通路介导心肌损伤[15-16]。其机制可能为4-PBA作为一个分子伴侣，通过阻断炎症信号，稳定蛋白构象而抑制ERS[17]。同时通过辅助内质网进行正确的蛋白折叠，减轻ERS负担，从而抑制 CHOP及其下游分子ERO1-α转录和翻译，减轻心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。本实验创新之处在于引入4-PBA，一方面利用其对ERS的阻断作用，证实ERS在Hcy致心肌细胞凋亡过程中的重要性，另一方面也为血清高Hcy的干预寻找可能的靶点。

总之，本研究证实了Hcy对心肌细胞的直接损伤，其对心肌细胞的损伤是通过促细胞凋亡实现的，至少有一条通路是通过激活ERS，促进PERK磷酸化，介导CHOP及ERO1α表达，导致细胞凋亡。同时本研究还有许多不足之处，比如，未探讨Hcy对ERS其他通路的影响，未进行体内实验等，这些不足课题组将在后续研究中加以补充。

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