Rho/ROCK通路在肿瘤转移中的作用及靶向治疗研究进展

苏 立，李 炯 综述，徐健众△ 审校

(重庆市中医院：1.肿瘤科；2.呼吸科 400021)

肿瘤转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因，因此成为当前肿瘤性疾病临床诊治中的难点和挑战。不同组织来源、病理类型的肿瘤在转移过程中其驱动基因、微环境信号、遵循的解剖路径各不相同，转移机制的复杂性和异质性给防控肿瘤转移带来巨大困难。但不同肿瘤在侵袭转移中也存在一些共同的细胞事件，共用一些分子通路。细胞的迁移运动就是各种肿瘤转移中共有的细胞事件。靶向细胞运动及其中关键的分子或信号通路，有可能成为多种肿瘤转移防治的有效策略[1]。Rho GTPase家族作为调控细胞骨架和细胞运动的重要分子家族被深入研究，该家族及相关信号通路在肿瘤侵袭转移中的作用也逐渐被揭示。近年来随着各种Rho信号通路抑制剂的发现，尤其是靶向Rho下游主要效应分子ROCK的多种抑制剂的研制成功，靶向Rho/ROCK信号通路成为抑制肿瘤转移研究中的热点之一。本文拟简要介绍Rho/ROCK信号通路的组成及特点，重点综述该信号通路在肿瘤中的异常，肿瘤转移中的作用及针对Rho/ROCK信号通路靶向治疗的现状及研究进展。

1 Rho/ROCK信号通路概述

Rho GTPase家族是属于Ras GTPase超家族的信号传导蛋白，1985年在无脊椎动物中作为Ras的同系物(Ras homology)被发现并得名[2]。目前已知哺乳动物的Rho GTPase家族包含22个成员，这些信号蛋白通过在活化(与GTP结合)与失活(与GDP结合)两种状态间切换，作为分子开关负责多种胞内信号的传导，通过调控细胞骨架的改构，从而影响细胞形态、运动、极性及细胞分裂和增殖等多种重要的细胞事件。Rho GTPase中研究得最多的是Rho(A、C)、Rac(1、2、3)和Cdc42。Rho相关鸟核苷酸交换因子 (guanine nucleotide exchange factors,GEFs)介导Rho GTPase和GTP结合使之活化，相反Rho相关GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)水解GTP成为GDP使其失活[3]。通常认为：Rac1 介导细胞板状伪足的生成，Cdc42诱导丝状伪足形成，而Rho亚家族主要促进应力纤维的形成，肌动蛋白收缩并介导细胞阿米巴样的迁移[4]。

RhoA和RhoC的下游主要效应分子是Rho相关激酶(Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK)。ROCK家族为丝苏氨酸蛋白激酶，包含2个成员：ROCK1和ROCK2，两者在蛋白结构上高度同源，因此其作用底物也相互重叠。活化的RhoA或RhoC激活ROCK1/2，后者可直接磷酸化肌球蛋白轻链 (myosin light chain,MLC)；或抑制性磷酸化肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase) 亚单位MYPT1，从而间接增强MLC的磷酸化；也可通过磷酸化激活LIMK1/2 (LIM domain kinase 1/2)使其下游底物cofilin被磷酸化抑制，进而阻断cofilin对肌动蛋白丝的切割作用。通过上述多种机制，活化的ROCK1/2总的作用是稳定肌动蛋白丝，增强其张力，从而调节细胞运动、形态、极性和收缩力[5]。因此抑制ROCK活性可以减弱细胞运动，提示Rho/ROCK信号通路可以作为抑制肿瘤转移的靶点。

2 Rho/ROCK信号通路在肿瘤中的异常

人类肿瘤中Rho/ROCK信号通路在多个层面上存在着异常，包括基因异常、表达异常及信号通路活性调控的异常。Rho/ROCK通路异常与肿瘤的发生、发展关系密切，并且与患者疾病的严重程度及预后相关。

2.1肿瘤中Rho/ROCK信号通路的基因异常 关键基因遗传上的突变是肿瘤发生的重要机制之一，Rho/ROCK通路的基因异常在众多肿瘤中被发现。近期肿瘤全基因组测序结果显示：在弥漫型胃癌中约25%的病例具有RhoA基因的重复性突变，突变热点集中在RhoA鸟苷酸结合域周围的Tyr42和Arg5，这些突变可能增强了RhoA的活性[6]。同时胃癌的某些病理类型也富含Rho相关GTP酶激活蛋白(GAPs)的突变[7]。此外Rho A基因突变还常见于头颈部癌[8]、多种淋巴瘤[9-10]。作为RhoA/C下游主要效应分子的ROCK基因在肿瘤中突变也很常见，现已经发现约有600余种ROCK1/2基因的体细胞基因突变。比如发现在肺腺癌中ROCK1的外显子倍增[11]，而ROCK2基因突变在非小细胞肺癌病例中同样占到很高的比例[12]，在周围神经鞘瘤中也发现了ROCK2基因拷贝数的增加和转录的增强[13]。这些ROCK基因的突变被认为与肿瘤的发生和恶性侵袭能力增强有关，但其他的ROCK1/2基因突变对肿瘤发生、发展的意义尚待明确。

2.2肿瘤中Rho/ROCK通路的表达异常 很多人类肿瘤中都发现了Rho/ROCK信号通路成分的表达异常，这些肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、睾丸癌等[14-15]，通常认为Rho/ROCK通路的高表达与患者预后不良相关。如在结直肠癌中通过组织芯片的免疫组化检测发现癌组织中ROCK1的表达较癌旁组织显着增高，且ROCK1蛋白的表达水平与患者的生存期呈负相关[16]。卵巢癌中RhoC的mRNA和蛋白水平较正常组织明显增高，高表达RhoC的病例其肿瘤分期晚，分化差[17]。迁移能力强的乳腺癌癌细胞中RhoA及ROCK1表达均增高，而乳腺癌组织中RhoA或ROCK1异常高表达的患者预后差。 GILKES等[18]研究发现缺氧可以在乳腺癌细胞中同时诱导RhoA和ROCK1的表达，而RhoA和ROCK1是缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)的直接转录调控的靶基因，肿瘤微环境缺氧信号通过HIF/RhoA/ROCK1信号轴增强了癌细胞的迁移能力。在肿瘤内部不同区域Rho/ROCK分子表达也存在差异，如在乳腺浸润性导管癌中发现RhoA在癌组织边缘的表达高于癌组织中央，而且肿瘤边缘的ROCK及F-actin的表达均增高[19]，这些表达的定位特点反映了在肿瘤侵袭性边缘存在Rho/ROCK信号通路的激活。

2.3肿瘤中Rho/ROCK 信号通路的异常激活 除了表达异常，肿瘤微环境中多种信号可以异常激活Rho/ROCK信号通路的活性。比如在微环境中增高的骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号能在SMAD4突变缺失的结直肠癌细胞中激活ROCK信号通路，诱导肠癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)并增强其侵袭迁移能力，使用ROCK抑制剂处理肠癌细胞则能阻断BMP信号诱导的EMT和细胞迁移[20]。乳腺癌组织中的缺氧信号在协同上调RhoA、ROCK1表达的同时也激活其活性，导致ROCK下游底物MLC的磷酸化增强，同时激活黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的活性，共同介导细胞的侵袭迁移[18]。雄激素能刺激前列腺癌细胞中的RhoA表达并激活其活性[21]，而在胰腺癌中表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)能够激活RhoA/ROCK，ROCK活化后能反作用于EGFR使之胞内化失活，形成了一种Rho/ROCK反作用于上游信号的负反馈调节机制。

肿瘤细胞中Rho/ROCK激活还具有空间上差异性调控的特点。如在乳腺癌中发现核内激活的ROCK2与高HER2、高Ki67、低雌孕激素受体表达相关，因而预后较差[22]。P53突变的小鼠胰腺导管癌中RhoA在癌细胞的前后缘激活，介导细胞迁移，小分子激酶抑制剂达沙替尼(dasatanib)能够抑制Rho在细胞的两极激活从而抑制癌细胞的运动[23]。而在乳腺癌和脑癌细胞中RhoA特异的鸟苷酸交换因子Syx，聚集到细胞膜下，在胞膜下激活RhoA下游效应分子Dia1并抑制ROCK活性，介导胞内微管结构的改变，从而调控细胞极性并促进细胞定向运动[24]。

3 Rho/ROCK 信号通路在肿瘤转移各环节中的作用

肿瘤转移是一个多步骤的复杂过程，肿瘤细胞、微环境间质及间质细胞、肿瘤血管都参与其中，每个环节都显着影响转移的最终结果。本文从这几个方面分别介绍Rho/ROCK信号通路的作用。

3.1肿瘤细胞中Rho/ROCK 通路的作用 类似于Rho/ROCK信号通路在正常细胞运动中的重要作用，已有相当多的证据表明Rho/ROCK通路也是大多数肿瘤细胞运动所必需的，而ROCK1/2抑制剂可在多种肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞的迁移运动[4,15]。EMT被认为是上皮来源的肿瘤细胞侵入周围组织的起始环节，Rho/ROCK信号通路也被发现参与肿瘤细胞的EMT过程。如ROCK介导了微环境中BMP信号诱导结直肠癌细胞的EMT过程[20]，而乳腺癌中RhoA及Rho相关鸟核苷酸交换因子均参与了癌细胞的EMT[19,25]。

完成EMT后进入间质的肿瘤细胞在其进一步的侵袭过程中，根据所处的周围环境的不同，通常采用两种不同形态的运动模式，即长梭形间质细胞样运动，或者圆形的阿米巴样的运动，这两种运动模式的动态转换是侵袭中的肿瘤细胞适应复杂多变的微环境所需要的，而这一转化过程的调节机制是Rho/ROCK和Rac1间相互抑制的环路：一方面Rac1信号维持细胞的长梭形间质样运动，并抑制Rho/ROCK的活性[4]；另一方面Rho /ROCK信号维持细胞阿米巴样的运动，并通过磷酸化激活2种Rac特异的GAP，即 ARHGAP22和FilGAP[26]，灭活Rac1，从而使细胞运动模式转变为阿米巴样。所以肿瘤细胞在间质中的运动模式取决于Rac1和Rho/ROCK间的平衡，阻断Rho/ROCK信号不仅能直接抑制细胞运动，而且影响癌细胞转换运动方式以适应周围环境的能力。

3.2肿瘤间质中Rho/ROCK 通路的作用 肿瘤间质及肿瘤间质细胞是影响肿瘤细胞生存、增殖、转移的重要因素。Rho/ROCK的重要作用也体现在肿瘤间质或肿瘤与其微环境的相互作用中。胆管癌具有丰富的肿瘤间质，并且间质中富含肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)，通常认为CAF由肿瘤细胞募集而来，但具体机制不明。近期研究发现胆管癌细胞通过分泌血小板源性生长因子D(platelet derivative growth factor D，PDGF-D)，经由成纤维细胞膜上的受体FDGFR-β激活其胞内的Rac1、RhoA和Cdc42，进而介导其迁移至肿瘤间质成为CAF。使用各种Rho GTPase抑制剂处理成纤维细胞，都能显着抑制PDGF-D诱导的成纤维细胞迁移[27]。

肿瘤转移中需要发生细胞外基质 (extracellular matrix,ECM) 重构。CAF细胞是调控ECM重构的主要细胞，而这一功能依赖于CAF中肌动球蛋白的收缩力。和其他细胞一样，CAF中肌动球蛋白收缩也由Rho/ROCK通路调控。研究表明肿瘤微环境中白血病抑制因子(leukemia inhibit factor,LIF)激活CAF中的JAK/STAT通路，其中JAK激活Rho/ROCK来增强肌动球蛋白收缩，以促进ECM的重构。同时增强的肌动球蛋白张力和激活的ROCK也促进STAT3的磷酸化，形成了CAF中JAK-ROCK的自身正反馈环路，其综合效应是促进ECM重构有利于肿瘤细胞侵袭转移[28-29]。TGF-β通过激活YAP(yes-associated protein)促使正常成纤维细胞向CAF转化，并维持CAF促进ECM重构的表型，这一过程也依赖于成纤维细胞内肌球蛋白收缩，因此ROCK抑制剂能够阻断正常成纤维细胞向CAF转化[30]。

3.3Rho/ROCK通路在肿瘤细胞侵入血管中的作用 肿瘤细胞进入血管是转移中的重要环节，近期研究还发现Rho/ROCK信号通路调控肿瘤细胞与血管内皮细胞相互作用，并参与肿瘤细胞跨血管壁的运动过程。在前列腺癌细胞中以RNAi敲低RhoC或ROCK1/2都能显着地抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附，并能抑制前列腺癌细胞诱导的内皮细胞间连接打开的作用。体内实验也证实敲低RhoC，能显着抑制前列腺癌细胞向免疫缺陷小鼠肺内的转移[31]。在肿瘤侵入血管的过程中激活Rho/ROCK的可以是微环境中细胞因子信号也可以是肿瘤间质细胞，如化学趋化因子CXCL12/SDF诱导的乳腺癌细胞中RhoA激活，促进肿瘤细胞向血管黏附并跨血管迁移[32]。肿瘤间质中的巨噬细胞在与肿瘤细胞的接触中，也可诱导肿瘤细胞内RhoA激活，使之形成富含肌动蛋白的侵袭性伪足，这有利于肿瘤细胞降解基质并穿透血管[33]。

研究发现肺癌细胞可以通过激活血管内皮细胞的Rho/ROCK通路，诱导内皮细胞的细胞骨架变化从而松解内皮细胞间连接，而凝血酶的刺激也可以使内皮细胞中Rho/ROCK活化从而导致血管内皮通透性增加[4]。使用ROCK抑制剂可以在脑出血动物模型中降低脑血管的通透性，并防止了内皮细胞间紧密连接的减少[34-35]，虽然在肿瘤动物模型中尚未进行这样的实验，但可以推测肿瘤性血管内皮细胞中Rho/ROCK信号通路也有类似的功能并受到ROCK抑制剂的调节。

4 Rho/ROCK 信号通路靶向治疗的研究进展

由于Rho/ROCK信号通路在肿瘤转移多个环节中的重要作用，研发Rho/ROCK的抑制剂用于肿瘤转移分子靶向治疗一直是研究的热点。现有的Rho/ROCK抑制剂主要是ROCK的抑制剂，早期发现的ROCK抑制剂包括fasudil、Y27632、hydroxyfasudil、H-1152P等，由于这些抑制剂都是针对ATP结合域附近的酶活性区域，所以它们没有ROCK1/2的选择性，而且在高浓度时对其他丝苏蛋白激酶如PKA、PKC也有抑制作用。新近研发的ROCK1/2选择性ROCK抑制剂，如KD-025/SLx-2119，其对ROCK2选择性比对ROCK1高200倍以上[36]。

由于Rho/ROCK信号通路在血管平滑肌细胞收缩和张力维持中的作用，目前已经有多种ROCK抑制剂在控制血压、治疗缺血性血管疾病方面进入了临床试验阶段。与这些非肿瘤领域的进展不同的是，虽然大量的实验性研究已证实Rho/ROCK抑制剂在细胞或实验动物中对肿瘤侵袭转移的抑制作用[37-38]，但至今仅有1种ROCK抑制剂，即AT 13148在2012年获批开始针对进展期实体瘤的临床Ⅰ期试验(ClinicalTrials.gov identifier NCT01585701)。Rho/ROCK抑制剂在肿瘤临床研究中进展缓慢的原因可能在于：Rho/ROCK信号通路分布广泛，参与的生理功能复杂，而目前的ROCK抑制剂大多不具备理想的组织或靶点的选择性，人体使用中具有不可预计的不良反应，这限制了该类药物的临床应用。此外目前对GTPase在肿瘤进展转移中的作用和机制远未阐明，但越来越清楚的事实是药物抑制Rho/ROCK信号通路的结果高度取决于肿瘤细胞自身的种类、疾病的状态及肿瘤内微环境，这些复杂性和不确定性给开发治疗肿瘤的Rho/ROCK抑制剂也带来了困难[39-40]。

综上所述，Rho/ROCK信号通路作为调控细胞骨架和细胞运动的重要信号系统在肿瘤转移的各个环节都发挥着重要的作用。该通路的遗传异常、异常表达或激活既是人类肿瘤中常见的分子事件，也是导致肿瘤进展转移的重要原因之一。因此Rho/ROCK也是抑制肿瘤进展和转移的潜在的分子靶点，目前由于该信号通路认识及相关抑制剂的研发尚不够完善，所以靶向Rho/ROCK的策略在肿瘤临床治疗中尚未能实现，不过相信随着研究的深入，新型抑制剂的问世，靶向Rho/ROCK会成为防控肿瘤转移的重要方法之一。

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