Bax、Bmi-1及PCNA在胶质瘤中的表达及意义*

续 岭，王 金，谢明祥，肖顺武，唐怀波，吴海涛，申 昊，赵洪新，犹春跃△

(遵义医学院附属医院:1.神经外科;2.神经内科，贵州遵义 563003)

胶质瘤是最为常见的恶性颅内肿瘤之一，占中枢神经恶性肿瘤的40%～50%，发病率、复发率及病死率居高不下。胶质瘤由于组织块生长迅速，侵袭性强致使组织边界模糊，依靠手术难以将肿瘤组织切除干净，导致术后患者预后较差[1-2]。因此为提高胶质瘤的治疗效果，进一步明确其发病机制至关重要。肿瘤的发生、发展与癌基因的激活，抑癌基因的失活，细胞凋亡基因及细胞增殖基因的异常表达等密切相关，胶质瘤也不例外[3]。Bcl-2家族是最为常见的细胞凋亡调控家族，B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)是其中的促凋亡蛋白，能自身形成二聚体，传递凋亡信号，诱导细胞凋亡，在众多肿瘤组织中低表达[4]。B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒整合位点1(Bmi-1)是多梳家族(PcG)成员之一，被认为是一种原癌基因，能与Bcl-2家族蛋白相互作用，抵抗细胞凋亡，在多种肿瘤组织中高表达[5-6]。增殖细胞核抗原(PCNA)是一种评价细胞增殖状态的核蛋白，与细胞有丝分裂密切相关，在众多肿瘤组织中高表达[7]。研究已证实Bax、Bmi-1及PCNA在胶质瘤中异常表达[4-7]，但三者在胶质瘤的联合检测及意义尚未见报道，因此本研究将对此展开探讨，以期对胶质瘤的诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2013年12月至2016年11月经遵义医学院附属医院手术切除并经病理科病理诊断证实为脑胶质瘤的组织标本98例，其中男54例，女44例，中位年龄45岁。按WHO 2007年神经系统肿瘤分类标准：Ⅰ级22例，Ⅱ级24例，Ⅲ级29例，Ⅳ级23例。另取48例同时期由于颅脑外伤进行内减压手术的脑组织标本作为正常对照。所有患者手术前均无化疗、放疗及生物治疗等，均经医院伦理学委员会同意及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法检测Bax、Bmi-1及PCNA表达 将石蜡标本置于二甲苯，无水乙醇，95%、85%、75%乙醇中脱蜡，接着将标本置于柠檬酸盐抗原修复盒中修复。10%山羊血清室温下封闭30 min。一抗(兔抗Bax、Bmi-1及PCNA多克隆抗体，稀释度1∶200)溶液，4 ℃过夜孵育，第2天于二抗溶液室温下孵育1 h，二氨基联苯氨(DAB)显色后冲洗。苏木素复染、1%盐酸分化，氨水反蓝。梯度乙醇中脱水，二甲苯中透明，中性树脂封片，并于显微镜下观察。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.2.2Western blot检测细胞中Bax、Bmi-1及PCNA蛋白表达 将组织标本匀浆并加入细胞裂解液裂解，离心，收获上清液即是总蛋白。利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白水平。制作浓缩胶和分离胶，并水封静置30 min。进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，后湿法转膜30～50 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗溶液(兔抗人Bax、Bmi-1、PCNA、GAPDH多克隆抗体，稀释度为1∶100)孵育，4 ℃过夜；第2天二抗溶液室温孵育1～2 h。于凝胶成像系统中曝光。

1.2.3结果判断 Bax蛋白主要是以在细胞质中出现棕黄色或者棕褐色的颗粒作为阳性表达；Bmi-1及PCNA蛋白主要是以细胞核中出现棕黄色或者棕褐色的颗粒为阳性表达。由工作经验丰富的病理科医师采用双盲法阅片并确诊。随机选择高倍镜的5个视野进行观察并计数。该切片的总得分是阳性细胞所占百分率评分乘以染色评分。按细胞的染色程度评分：未染色的标为0分，染浅黄色的标为1分，染棕黄色的标为2分，染棕褐色的标为3分。按阳性细胞所占百分率评分：未染色的标为0分，<25%标为1分，25%～<50%标为2分，≥50%标为3分。

2 结 果

2.1免疫组织化学检测Bax、Bmi-1及PCNA在胶质瘤及正常组织中的表达 胶质瘤组织中Bax阳性率显着低于正常组织(P<0.05)，Bmi-1及PCNA阳性率均显着高于正常组织(P<0.05)，见表1。

表1 Bax、Bmi-1及PCNA在胶质瘤及正常组织中的阳性表达[n(%)]

2.2Bax、Bmi-1及PCNA阳性表达与胶质瘤级别的关系 Ⅲ～Ⅳ级中Bax阳性率显着低于Ⅰ～Ⅱ级(P<0.05)，Bmi-1及PCNA阳性率均显着高于Ⅰ～Ⅱ级(P<0.05),见表2。

A：胶质瘤组织；B：正常组织

图1 Western blot检测Bax、Bmi-1及PCNA在

胶质瘤及正常组织中的蛋白表达

A：Ⅰ～Ⅱ级；B：Ⅲ～Ⅳ级

图2 Bax、Bmi-1及PCNA蛋白表达与胶质瘤级别的关系

2.3Bax、Bmi-1及PCNA在胶质瘤及正常组织中蛋白表达 胶质瘤组织中Bax蛋白表达量显着低于正常组织(P<0.05)，Bmi-1及PCNA蛋白表达量均显着高于正常组织(P<0.05)，见图1。

2.4Bax、Bmi-1及PCNA蛋白表达与胶质瘤级别的关系 Ⅲ～Ⅳ级中Bax蛋白表达量显着低于Ⅰ～Ⅱ级(P<0.05)；Bmi-1及PCNA蛋白表达量均显着高于Ⅰ～Ⅱ级(P<0.05)，见图2。

2.5胶质瘤组织中Bax、Bmi-1及PCNA表达的关系 经Spearman相关性分析表明，Bax与Bmi-1、PCNA表达呈负相关(r=-0.438、-0.527，P=0.000)，Bmi-1与PCNA表达无关(r=0.231，P>0.05)。

3 讨 论

众多研究表明，原癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞凋亡相关基因及细胞增殖相关基因的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，进而提示检测肿瘤组织中细胞凋亡相关基因的表达可能成为肿瘤诊断、预后的有效手段[3]。Bax是于1993年在人和鼠B细胞中发现的一种促凋亡蛋白，能自身形成二聚体，将凋亡信号传递给Caspase家族，促使Caspase家族信号放大，最终诱导细胞凋亡。目前研究显示Bax在包括胶质瘤中的多种肿瘤组织中低表达甚至缺失，杨立军[4]的研究证实胶质瘤组织中的Bax阳性率显着低于正常脑组织，且随肿瘤级别提高阳性率逐渐下降。于泽奇等[8]研究也证实随着胶质瘤级别的升高，Bax阳性率逐渐降低(100%、82.4%、16.1%)。本研究免疫组织化学及Western blot结果表明胶质瘤组织Bax的蛋白表达量及阳性率均显着低于正常组织，且Ⅲ～Ⅳ级的表达量及阳性率低于Ⅰ～Ⅱ级，与杨立军[4]，于泽奇等[8]研究结果一致。说明Bax的表达水平对胶质瘤的恶性程度起到诊断作用，对患者预后评估具有重要意义。

Bmi-1是1991年荷兰癌症中心发现的一种与c-myc同源的原癌基因，能够通过调控组蛋白的乙酰化与去乙酰化过程，影响细胞的增殖与凋亡[5-6]。研究显示Bmi-1在多种肿瘤组织中异常表达，与肿瘤的发生、发展密切相关。MADATHAN等[9]采用SYBR®qRT-PCR及Westernn blot方法检测50例胶质瘤组织中Bmi-1 mRNA及蛋白表达，结果表明胶质瘤中Bmi-1 mRNA(36/50，72.0%)及蛋白(37/50，74.0%)表达量显着高于正常脑组织。单峤等[10]证实胶质瘤组织中Bmi-1蛋白及mRNA表达量显着高于正常脑组织。本研究免疫组织化学及Western blot结果表明胶质瘤组织Bmi-1的蛋白表达量及阳性率均显着高于正常组织，与上述研究一致。且本研究还表明Ⅲ～Ⅳ级中Bmi-1的表达量及阳性率高于Ⅰ～Ⅱ级，与王耀东等[6]、单峤等[10]研究结果一致，说明Bmi-1的表达促进了胶质瘤的发展。

PCNA是MAHLER等[7]于系统性红斑狼疮中发现的一种细胞核蛋白，是DNA复制的辅助蛋白，在细胞周期的G0期开始合成，S期达到峰值，是反映细胞增殖状态的有效标记物。LV等[11]通过Meta分析证实PCNA与胶质瘤、宫颈癌患者5年生存率、高病理级别及高WHO级别密切相关，并提示PCNA可作为宫颈癌、胶质瘤甚至更多肿瘤有效的诊断、预后标记物，或者有效治疗靶点。WANG等[12]研究表明PCNA在正常脑组织中不表达，随着级别的增加PCNA阳性率升高。本研究与WANG等[12]研究结果一致，胶质瘤组织中PCNA阳性率及蛋白表达量显着高于正常组织，且病理级别研究还显示Ⅲ～Ⅳ级中PCNA的表达量及阳性率高于Ⅰ～Ⅱ级。从而说明PCNA的表达与胶质瘤的进展密切相关，PCNA可能成为胶质瘤治疗的有效靶点。

本研究经Spearman相关性分析证实胶质瘤中Bax与Bmi-1、PCNA表达呈负相关，Bmi-1与PCNA表达无关。有研究证实肺癌患者血清中PCNA与Bax表达呈负相关，二者联合检测对肺癌患者的诊断及预后具有重要意义[13]。喉鳞癌中Bax及Bmi-1表达呈负相关，且低表达的Bax、高表达的Bmi-1能显着促进喉鳞癌的发展[14]。PCNA及Bmi-1在皮肤鳞状细胞癌中的表达无相关性，提示二者独立影响皮肤鳞状细胞癌的分化、浸润及转移[15]。从而说明Bmi-1及Bax，PCNA及Bax对胶质瘤的恶性发展具有相关的机制调控，而Bmi-1及PCNA对胶质瘤的发展具有独立作用，互不干扰。

综上所述，Bax在胶质瘤中低表达且阳性率随着病理分级升高而降低，PCNA与Bmi-1在胶质瘤中高表达且阳性率随着病理分级升高而提高，三者联合检测可成为胶质瘤预后的标记物。

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