周 俊，叶 丽，林凡莉，汪姝玥，李晓明，黄纯兰△
(1.西南医科大学临床医学院，四川泸州 646000；2.西南医科大学附属医院血液内科，四川泸州 646000)
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)居血液系统恶性肿瘤第2位，目前仍是临床无法治愈的疾病。MM以骨髓微龛中瘤型浆细胞克隆、增殖，血液、尿液中单克隆蛋白增多为主要特点，终末器官损害主要表现为贫血、肾功能不全、骨痛、高钙血症等[1-3]。趋化因子配体12(CXCL12)及趋化因子受体4(CXCR4)形成CXCL12/CXCR4生物轴在多种肿瘤中发现,能够促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤血管生成,影响某些肿瘤的靶向转移,增强肿瘤细胞的黏附和迁移能力,影响肿瘤细胞的分泌行为等[4-7]，其在MM中的作用机制有待进一步研究，本研究通过测定MM患者骨髓活检组织中CXCL12、CXCR4、微血管密度(microvessel density，MVD)的表达、分布，以研究其在MM中表达并对临床意义进行讨论，现报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 选择2013年1月至2016年7月西南医科大学附属医院血液科收治的MM患者63例作为试验组，其中男34例，女29例，平均年龄(59.73±8.85)岁，MM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期42例，免疫球蛋白分型轻链型11例，IgG型33例，IgA型19例，血清轻链分型λ型26例，κ型37例。所有患者均符合中国MM诊治指南(2015年修订)中MM诊断标准[8]。选择同期健康人42例作为对照组，其中男20例，女22例，平均年龄(60.20±13.37)岁。
1.2方法
1.2.1检测方式 用免疫组织化学SP法，检测试验组、对照组骨髓活检组织标本中CXCL12、CXCR4及MVD的表达。收集骨髓活检组织蜡块4 μm厚连续切片，依次行脱蜡水化、抗原修复、一抗、二抗孵育、二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木精复染、分化-封片、镜检、拍照。用已知阳性切片做阳性对照，以磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替一抗做阴性对照。并收集两组性别、年龄、临床分期、免疫球蛋白、轻链分型临床资料，将上述资料进行统计学相关分析。
1.2.2结果判定 骨髓组织细胞的细胞质和细胞膜内出现棕黄色着色颗粒为CXCL12和CXCR4阳性细胞，结果评价用SP法染色强度(阳性)和阳性细胞百分比确定。随机观察10个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞，根据其中阳性细胞所占百分比和染色强度分别进行评分，最后综合评定结果。(1)阳性细胞所占百分比评分：<10%为0分，10%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分。(2)染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，淡黄色至黄色为2分，黄色至棕黄色为3分。(3) 结果判断：染色强度和阳性细胞分值之和为最终分值。总积分0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中强阳性(++)，6分及以上为强阳性(+++)。细胞质出现棕黄色着色颗粒为MVD阳性细胞，首先形态学观察：在低倍光学显微镜下(×100)判断骨髓病理切片的取材、染色是否成功，骨髓增生程度，微血管分布情况；高倍镜下(×400)观察内皮细胞、微血管形态，并进行微血管计数。骨髓MVD计数：对每张切片进行 MVD 计数。首先在低倍镜下(×100)进行逐个视野的观察，至少选出 3 个血管最丰富且不相连的热点区域，然后在高倍镜下(×400)计数微血管，共计数 3 次，取其平均值表示 MVD。任何呈棕黄色的能够计数的血管，不以是否有管腔或管腔中是否有红细胞作为判断标准，骨小梁内或与骨小梁相连的血管被排除在外。
2 结 果
2.1CXCL12、CXCR4和MVD染色情况 CXCL12、CXCR4蛋白表达阳性染色位于骨髓细胞细胞质，染色颗粒呈浅黄色或棕黄色；MVD蛋白表达阳性染色位于细胞膜，见图1～3。
A:对照组骨髓中细胞染色呈黄色，细胞散在表达，呈弱阳性；B:试验组骨髓中细胞弥漫表达，呈棕黄色，呈强阳性
图1两组骨髓中CXCL12染色(×400)
A:对照组骨髓中细胞染色呈黄色，细胞散在表达，呈弱阳性；B:试验组骨髓中细胞弥漫表达，呈棕黄色，呈强阳性
图2两组骨髓中CXCR4染色(×400)
A:对照组骨髓显示微小血管形态规则，结构良好；B:试验组骨髓显示微血管明显增多，微血管形态不规则，大小不一；C:试验组骨髓可见单个内皮细胞，内皮细胞团簇，甚至成线状排列未见明显管腔
图3 两组骨髓中MVD染色(×400)
2.2CXCL12、CXCR4和MVD蛋白表达情况 试验组骨髓CXCL12、CXCR4和MVD表达明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。MM患者骨髓CXCL12、CXCR4和MVD的表达与患者性别、年龄、免疫球蛋白、轻链分型表达差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3相关性分析结果 MM的骨髓CXCL12表达与CXCR4、MVD表达均呈正相关，见表1。
3 讨 论
MM是骨髓中浆细胞呈恶性克隆的增殖性疾病，可累及骨髓、血液、肾脏等多个靶器官，骨髓微环境也受浆细胞影响发生相应变化。诸多学者就分子、因子等多方面对MM微环境改变、血管生成机制等进行研究[9-14]。
CXCL12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，属于CXC族趋化因子成员，对骨髓基质细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞等均有趋化作用，而这些细胞也都表达CXCR4。CXCR4是CXCL12的特异受体，是由352个氨基酸组成的G蛋白偶联受体。CXCL12/CXCR4生物轴在调节肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、血管生成中具有重要作用[15-19]。MM细胞可表达CXCR4，CXCL12 与 CXCR4 相互作用，趋化MM细胞的迁移和定居在骨髓微环境[20-21]。本研究试验组CXCL12、CXCR4的表达较对照组明显增加，与以上观点相符合，CXCL12、CXCR4与MM的发生相关，因此推测CXCL12/CXCR4生物轴在MM发病机制中具有重要作用。此外，该生物轴与骨髓微环境中血管新生具有密切关系。CXCL12/CXCR4生物轴可通过促进血管内皮生长因子(VEGF)分泌促进血管生成[22-25]。既往多项研究表明血管新生与恶性血液病发生、演变、预后密切相关[26-27]。MM骨髓活检中MVD明显高于对照组，表明血管新生与MM的发生有明显关系。肿瘤的发生、发展有赖于新生血管的形成，而CXCL12/CXCR4与血管新生过程密切相关[28]。在肿瘤缺氧环境下，由缺氧因子诱导，VEGF大量表达，CXCL12表达也明显升高。ECONOMIDOU等[29]研究发现CXCL12/CXCR4在恶性胸腔积液中高度表达，并发现CXCL12与VEGF呈正相关，因此认为CXCL12上调VEGF的表达，促进血管新生。本研究表明，MM组骨髓CXCL12/CXCR4的表达与MVD的表达呈正相关，故推测MM骨髓微环境中CXCL12/CXCR4生物轴可促进血管新生，因此可认为抑制CXCL12/CXCR4在微血管形成的作用会成为抗肿瘤治疗的新途径。
综上所述，骨髓微环境中血管新生机制可能成为治疗MM的新靶点，通过抑制CXCL12/CXCR4生物轴抗血管新生可为MM的发病机制及寻找有效的诊断和治疗提供新的途径。
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