周 珊，刘彦婷，赵飞鹏，冯华君，涂晓敏，杨金亮，梁传余，覃 纲△
(1.西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川泸州 646000；2.四川大学生物治疗国家重点实验室，成都 610041；3.四川大学华西医院耳鼻咽喉头颈外科，成都 610041)
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种头颈部常见的恶性肿瘤，多起源于鼻咽黏膜的上皮，在西方国家发病率极低(0.5/100 000)，但高发于我国南方(30/100 000)[1]。经以放疗为主的综合治疗，早期NPC患者5年生存率可达90%，而晚期NPC患者的5年生存率仅维持在70%左右，甚至更低[2]。因此，研究NPC的发病机制和寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是一类重要的免疫球蛋白分子，经典的免疫学理论认为仅由B淋巴细胞产生。近年的研究发现，上皮来源的组织和细胞系也可以表达Ig，如IgA、IgG和IgM[3-4]。研究证实，IgM在多种人上皮来源的肿瘤细胞中高表达，可能参与肿瘤免疫反应[5]，在肝癌、前列腺癌和卵巢癌的筛选和诊断方面具有生物标志物的潜力[6-8]。然而，IgM在NPC中的表达和功能尚不明确。本研究旨在探讨抗人IgM抗体对NPC HNE-1细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，并构建裸鼠移植瘤模型进行验证，为NPC的研究提供新的思路。
1 材料与方法
1.1材料与试剂 人鼻咽癌HNE-1细胞系由四川大学华西医院实验室提供；RPMI-1640和胎牛血清(FBS)购自美国Thermo公司；羊抗人IgM抗体、羊抗IgG纯化免疫球蛋白和碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma公司；3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)实验试剂盒和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测试剂盒均购自美国Promega公司；细胞周期检测试剂盒购自南京吉凯科技有限公司；兔抗人gp96多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人IgM多克隆抗体、生物素化羊抗IgG抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组织化学SP试剂盒购自美国Santa Cruz公司；BALB/c-nu裸鼠(雌性)购自成都达硕实验动物有限公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养 HNE-1细胞在37 ℃、5% CO2的饱和湿度孵箱中采用含10% FBS+1%青链霉素的RPMI-1640培养基培养。
1.2.2细胞增殖检测 严格按照试剂盒说明书进行。浓度梯度检测：取对数生长期的细胞，以2×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后，弃培养液，分3组加药：实验组(100 μL含不同浓度羊抗人IgM抗体+含2.5% FBS的RMPI-1640)、IgG/磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(100 μL含相同浓度羊抗IgG或PBS+含2.5% FBS的RMPI-1640)、空白对照组(100 μL 含2.5% FBS的RMPI-1640)，羊抗人IgM抗体、羊抗IgG和PBS设置的浓度梯度均为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL，设置校正孔，未接种细胞，加入100 μL含2.5% FBS的RMPI-1640校正吸光度值(A值)，培养3 d后，加入20 μL MTS，酶标仪测490 nm处A值(A490值)。时间梯度检测：种板、分组同前，培养24 h后，弃培养液，分3组加药，每隔24 h加入20 μL MTS，酶标仪测A490值，连续测6 d。空白对照组调零，每组设3个复孔，重复3次；细胞增殖抑制率(%)=(1-处理组A490/空白对照组A490)×100%。
1.2.3细胞凋亡检测 流式细胞仪检测：将细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，含10% FBS的RPMI-1640培养24 h，弃上清液；分3组，对应分别加1 mL含已调整浓度为200 μg/mL的羊抗人IgM抗体、羊抗IgG或含有相同体积的PBS的2.5% FBS的RMPI-1640，继续培养72 h；收集每孔细胞制成含(1～5)×106个细胞的单细胞悬液，离心，70%乙醇固定，加1 mL PI染液，调整细胞密度为5×105个/毫升，上机检测及铺片拍照；细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞总数/总细胞数)×100%。TUNEL试剂盒检测：按试剂盒说明书进行，将细胞以2×103个/孔接种于96孔板中培养；阴性对照组以1 μL双蒸水代替rTdT酶，阳性对照组以DnaseⅠ预处理细胞，通过荧光显微镜观察拍照，将细胞核呈强蓝色荧光的细胞作为阳性细胞；细胞凋亡指数(%)=(一个视野的凋亡细胞数/通过视野的细胞总数)×100%。
1.2.4细胞周期检测 按照周期试剂盒说明书处理细胞，调整细胞密度为5×105个/毫升，流式细胞仪检测红色荧光，用Multicycle软件分析。
1.2.5体内移植瘤实验 将1×106个HNE-1细胞皮下接种于雌性BALB/c-nu裸鼠(4～5周龄)的右背腹侧；建模成功后，随机分成实验组、IgG对照组和PBS对照组，分别于腹腔注射等量的羊抗人IgM抗体、羊抗IgG及PBS，每3天注射1次，每只裸鼠1.5 mg，共5次；每4天测肿瘤体积；在第5次给药完成后1周处死裸鼠，剥离移植瘤，称重。瘤体体积=(D×d2)/2，D为最长径，d为最短径。动物实验得到西南医科大学动物实验伦理委员会的批准，批准号为201605045。
A：培养72 h后，3组细胞在不同浓度下的A490值曲线；B：培养72 h后，3组细胞在不同浓度下的增殖抑制率曲线；C：3组细胞在不同时间下的A490值曲线；D：3组细胞在不同时间下的增殖抑制率曲线；*：P<0.05，与PBS对照组、IgG对照组比较
图1抗人IgM抗体抑制HNE-1细胞增殖
A：3组细胞PI染色后的凋亡形态观察(×200)；B：流式细胞术测3组细胞凋亡的柱形图；C：3组细胞TUNEL染色后的凋亡形态观察(×200)；D：TUNEL染色后3组细胞凋亡的柱形图；*：P<0.05，#：P<0.01，与实验组比较
图2抗人IgM抗体诱导HNE-1细胞凋亡
1.2.6免疫组织化学检测 将石蜡包埋的移植瘤组织4 μm切片，按免疫组织化学SP试剂盒说明书进行；双盲法观察每张切片的阳性表达，细胞质呈黄棕色为阳性表达；每张切片选5个视野，显微镜(×400倍)下拍照，Image Pro-Plus 6.0图像分析软件检测平均光密度(MOD)值。
2 结 果
2.1抗人IgM抗体对HNE-1细胞增殖的影响 与IgG和PBS对照组比较，不同浓度抗人IgM抗体培养HNE-1细胞72 h后，随浓度的增加A490值减小，增殖抑制率增加，从浓度为50 μg/mL开始，A490值和增殖抑制率出现明显差异，见图1A、B。含100 μg/mL浓度的抗人IgM抗体培养HNE-1细胞6 d，结果显示：A490值和增殖抑制率随时间的增加而增加；与IgG和PBS对照组比较，实验组从第3天出现明显抑制，见图1C、D。
2.2抗人IgM抗体对HNE-1细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果：浓度为200 μg/mL的抗人IgM抗体作用于实验组HNE-1细胞，培养72 h后显示，实验组的凋亡率[(31.10±2.81)%]明显高于IgG对照组[(6.56±1.14)%]和PBS对照组[(7.79±1.21)%]，差异有统计学意义(F=161.667 3，P<0.05)，见图2B；并且用PI染色也可观察到类似结果，见图2A。TUNEL检测结果：HNE-1细胞经含抗人IgM抗体培养基培养72 h后，细胞凋亡明显，呈较强的绿色荧光，见图2C；实验组凋亡指数[(26.19±2.17)%]明显高于IgG对照组[(4.18±0.27)%]和PBS对照组[(3.38±0.77)%]，差异有统计学意义(F=281.098 9，P<0.01)，见图2D。
2.3抗人IgM抗体对HNE-1细胞周期的影响 流式细胞检测结果显示，与IgG对照组和PBS对照组比较，实验组HNE-1细胞G1期细胞百分比减少、S期细胞百分比增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
*：P<0.05，与实验组比较
图3流式细胞仪检测HNE-1细胞周期分布
2.4抗人IgM抗体对移植瘤的影响 裸鼠皮下接种HNE-1细胞，成功构建移植瘤模型，分3组(每组5只)，3组裸鼠在实验期间均无死亡。实验结果显示：腹腔注射药物结束后1周，实验组的平均瘤体体积[(26.73±16.51)mm3]明显低于IgG对照组[(204.97±151.88)mm3]和PBS对照组[(230.16±167.78)mm3]，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组的瘤体平均质量[(0.09±0.07)g]明显低于IgG对照组[(0.35±0.10)g]和PBS对照组[(0.38±0.08)g]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。相对于IgG对照组和PBS对照组，实验组的瘤体质量抑瘤率分别为74.29%和76.32%。
A：瘤体体积；B：瘤体质量；*：P<0.05，与PBS对照组、IgG对照组比较
图4裸鼠移植生长情况
2.5移植瘤中IgM与糖蛋白96(gp96)的表达 将HNE-1移植瘤组织切片行免疫组织化学染色，结果显示：IgM蛋白和gp96蛋白主要表达于细胞质中，呈棕黄色，见图5；实验组的IgMMOD值(0.01±0.01)明显低于IgG对照组(0.06±0.03)和PBS对照组(0.05±0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)；同样，实验组的gp96MOD值(0.05±0.01)明显低于IgG组(0.10±0.03)和PBS对照组(0.11±0.02)，差异有统计学意义(P<0.05)。
图5 免疫组织化学检测瘤体中IgM和gp96蛋白的表达(×400)
3 讨 论
目前，上皮来源的恶性肿瘤组织和细胞中Ig的生物学活性和潜在机制已成为肿瘤研究的热点之一。如ZHENG等[3]研究发现，人上皮肿瘤细胞衍生的IgA轻链可以诱导S期增加，促进细胞生长。尿道上皮肿瘤中IgG的高表达可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡；抗IgG抗体可诱导其细胞凋亡，IgG也可抑制胰腺癌细胞凋亡，促进肿瘤生长[9]。QIU等[10]证实了肿瘤细胞分泌的IgG是细胞生存和生长所必需的，利用特异性羊抗IgG抗体可诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制裸鼠移植瘤的生长，提出肿瘤来源的IgG能促进肿瘤细胞的生长。最近，观察到含特异性CDR3片段的反义重组载体能够抑制结肠癌HT-29细胞中Ig表达，诱导细胞凋亡，成功地抑制肿瘤细胞的增殖，认为肿瘤来源的Ig能够促进细胞增殖及生长，即肿瘤细胞衍生的Ig具有生长因子样活性[11]。
同样，本实验结果也揭示了抗人IgM抗体可能具有抑制HNE-1细胞增殖和生长的作用，并且抗人IgM抗体能有效地诱导HNE-1细胞凋亡。ZHENG等[3]发现抗人Igα单克隆抗体封闭肿瘤细胞Ig的功能，抑制CNE-1和Hela细胞的生长活性，随后进一步证实Igα能够增加其恶性增殖能力，而且发现肿瘤来源的Igα可促进细胞周期进入S期。本研究结果显示，抗人IgM抗体改变HNE-1细胞周期分布，阻滞于S期，G1期减少，与ZHENG等[3]结果一致。
gp96属于热休克蛋白90(HSP90)家族中的一个成员，能够参与肿瘤抗原的合成、装配及抗原提呈，与肿瘤特异性抗原肽结合形成gp96-肽复合物，激活抗肿瘤特异性免疫应答和免疫调节[12]。gp96在多种恶性肿瘤细胞中高表达，可能是恶性肿瘤诊断和免疫的靶点。研究表明，在喉癌组织高表达的gp96与喉癌的发生、发展和预后相关[13]。QIAN等[14]发现提取不同骨髓瘤细胞系分泌的gp96混合成疫苗，可抑制小鼠骨髓瘤的侵袭。以上研究证明gp96在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。有研究报道，肺癌组织中gp96和IgG高表达，可能二者共同参与肿瘤的免疫防御和逃逸[15]。在本实验中构建裸鼠移植瘤模型，发现抗人IgM抗体可抑制移植瘤的生长，免疫组织化学检测瘤体组织中IgM和gp96表达情况，发现实验组中IgM和gp96表达明显低于对照组(P<0.05)，提示抗人IgM抗体能抑制移植瘤的生长可能与抑制IgM和gp96蛋白表达有关。
综上所述，抗人IgM抗体能抑制HNE-1细胞的增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于S期，减少细胞的G1期，并可能通过抑制IgM和gp96蛋白的表达进而抑制裸鼠移植瘤的生长。本研究结果可能为抗NPC研究提供新的思路。
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