韩小胜,黄 会，魏小斌

(海南省海口市人民医院检验科 570208)

儿童哮喘近年来发病率逐渐上升，严重影响其生长发育及身心健康[1]。目前较多文献报道哮喘的发病与外界环境中的过敏原如尘螨、真菌等密切相关[2]，此外酸性哺乳动物几丁质酶(acid mammals chitinase，AMcase)引发的炎性反应与哮喘的发生也有关系[3-4]，但目前真菌特异抗体及AMcase是否参与哮喘疾病发展的报道不多。本研究通过收集本院哮喘患儿支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，对其中AMcase和真菌特异性抗体进行检测，探究AMcase、真菌特异性抗体与哮喘严重程度的关系，为治疗儿童型哮喘提供一定的参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年7月至2016年11月本院收治的96例支气管哮喘患儿作为研究对象，其中男57 例，女39 例，年龄2～12 岁，平均(5.84±2.57) 岁，符合儿科哮喘防治协会规定的哮喘诊断标准，根据全球哮喘防治策略(GINA)分级标准[5]将患儿分为轻度组(54 例)、中度组(26 例)、重度组(16 例)，另选取同期经纤维支气管镜为支气管异物儿童30 例作为对照组，其中男18 例，女12 例，年龄1～11 岁，平均(5.65±2.38) 岁，两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)入选患儿均符合儿科哮喘防治协会规定的哮喘诊断标准[6]；(2)年龄小于或等于12岁；(3)患儿家属知情同意。排除标准：(1)个人或家族具有哮喘病史；(2)喉软化及支气管狭窄等先天因素导致；(3)心、肝、血液等系统慢性病症；(4)合并慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、呼吸衰竭等肺部疾病者；(5)不能配合完成检测者。

表1 各组患儿临床指标比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

1.2方法

1.2.1BALF收集 所有哮喘患儿取左肺舌叶病变部位支气管肺段灌洗，对照组取病灶对侧肺段灌洗，采用37 ℃消毒生理盐水灌洗，使用量为150 mL，浓度为0.5 mL/kg，使用回收率超过60%，过滤BALF离心后保留上清液放置-20 ℃中保存，下层细胞采用血细胞计数器测定细胞总数，选取200个细胞进行细胞分类统计。

1.2.2酶联免疫法测定BALF上清液中免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量 参照相关文献结合本地空气中较多真菌类型，对BALF上清液进行真菌特异性抗体水平测定，IgE酶联免疫试剂盒购于美国R&D公司，IgA、IgG酶联免疫试剂盒购于美国RayBiotech公司，参照试剂盒进行操作。

1.2.3反转录PCR测定BALF上清液中AMcase mRNA表达 采用RNA提取试剂盒(Takara公司)提取BALF上清液中RNA进行提取，反转录为cDNA。反应体系：10×cDNA模板1.0 μL,上下游引物各0.5 μL,H2O 8.0 μL,2×SYBR Mix 10.0 μL。按照反应程序95 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，30个循环，72 ℃ 10 min。利用CFX manager 3.0软件进行Cq值分析,按照2-ΔΔCq算法进行定量表达分析。

1.2.4Western blot检测BALF中AMcase表达 在BALF上清液中加入蛋白裂解液在冰上进行30 min裂解反应，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳结束后在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上行转膜反应，TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶封闭后，加入AMcase一抗稀释液(美国R&D公司)，4 ℃振荡过夜，加入二抗稀释液(美国R&D公司)，室温下孵育2 h，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗后用凝胶成像仪对蛋白表达结果进行分析。

2 结 果

2.1各组研究对象临床指标对比 不同程度哮喘患儿中性粒细胞比例、巨噬细胞比例、嗜酸性粒细胞比例均高于对照组，淋巴细胞比例低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2BALF上清液中真菌感染及特异性IgE、IgA、IgG含量 哮喘患儿真菌感染主要为青霉菌、曲霉菌、链铬孢和白色念珠菌。不同程度哮喘患儿BALF上清液中特异性IgE水平均高于对照组，特异性IgA、IgG均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2～5。

表2 各组感染真菌情况(n)

2.3反转录PCR法测定BALF上清液中AMcase mRNA表达 不同程度哮喘患儿BALF上清液AMcase mRNA表达水平均高于对照组，AMcase mRNA表达水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

a：P<0.05，与重度组比较；b：P<0.05，与中度组比较；c：P<0.05，与轻度组比较

表3 BALF上清液中真菌特异性IgE水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

表4 BALF上清液中真菌特异性IgA水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

表5 BALF上清液中真菌特异性IgG水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

图2 BALF中AMcase蛋白的表达

表6 BALF中AMcase蛋白扫描灰度值

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

2.4Western blot检测BALF中AMcase蛋白表达 与对照组比较，不同程度哮喘患儿BALF中AMcase蛋白表达逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表6。

3 讨 论

支气管哮喘临床特征主要表现为反复性喘息、胸闷、呼吸困难且在清晨或夜间症状加剧[7]。过敏原广泛存在空气中并在哮喘的发病中起着关键性作用，暴露在空气中的真菌孢子是哮喘患者重要的过敏原[8]。此外AMcase是引发哮喘的重要介质，尤其是病情严重的哮喘，本研究通过检测不同程度哮喘患儿BALF中AMcase及真菌特异性抗体，进而探究哮喘发病机理。

以往研究认为哮喘主要病理特征为嗜酸性粒细胞浸润[9-10]，动物研究结果显示在小鼠BALF中嗜酸性粒细胞高达70%，而中性粒细胞比例较低[11]。有研究发现在轻度、中度患者中以嗜酸性粒细胞浸润为主，而重度哮喘患者中性粒细胞比例明显增加，且与病情严重程度呈正相关[12]。本研究结果显示哮喘患儿中，中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞比例随着病情程度的加重逐渐升高，淋巴细胞比例逐渐降低，表明中性粒细胞水平升高可能是导致哮喘的主要因素。

真菌在周围空气中较常见，如青霉菌、曲霉菌、草分支孢子菌等，进入气道后定植，刺激机体产生毒素及酶辅助炎性反应[13]。国外研究显示草分支孢子菌致敏率的增加，患者哮喘加重[14]。此外研究显示在ICU的哮喘患者中，草分支孢子菌、青霉菌等真菌致敏患者超过50%，且与患者哮喘程度呈正相关[15]。本研究结果显示青霉菌、曲霉菌、链铬孢、白色念珠菌特异性抗体随着病情加重，IgE水平逐渐升高，IgA、IgG水平逐渐降低，与邹晖等[16]研究相符，表明真菌特异性IgE与哮喘患儿病情有关，可能作为评估哮喘病情的指标。

AMcase为哺乳动物体内几丁质酶，可通过影响辅助T细胞2(Th2)炎症因子的表达参与哮喘的发病[17]。微生物研究证实AMcase能够水解真菌细胞壁的重要组成成分-几丁质，对于真菌具有较好的抗菌性[19]。BIRBEN等[20]研究证实机体受到含有几丁质病原菌刺激会后机体内AMcase水平明显升高，进一步诱发EOS聚集反应，在哮喘等过敏性疾病中发挥重要作用。本研究结果显示随着哮喘病情程度的加重，BALF中AMcase表达逐渐升高，表明在受到过敏原刺激后AMcase表达水平逐渐升高，进而导致疾病程度加重，可能作为哮喘病情的指标。

总之，哮喘患儿BALF中AMcase、真菌特异性抗体水平与病情严重程度相关，可作为评估哮喘病情的指标，为临床治疗哮喘提供一定的参考。本研究也存在一定的局限性，样本量较小，未对空气中其他过敏原进行检测使结论受到一定限制，后续应深入研究。