张文涛，吴先昊，梁冰洁，甘彩玉，郑作文△
(1.广西中医药大学药理教研室，南宁 530200；2.江西省中医药研究院中药药理室，南昌 330046)
藤茶总黄酮(tengcha flavonoids，TF)为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡植物中提取的黄酮类成分。藤茶在民间常有应用，是重要的民族用药。主要用于治疗急性结膜炎、感冒发热、咽喉肿痛、肝炎等疾病[1]。本课题组前期药理研究表明，TF具有明显地抗肝纤维化的作用[2]，但其机制未明，本研究通过应用TF灌胃来干预小鼠肝纤维化模型，探讨TF抗肝纤维化的机制，现报道如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1动物 昆明种小鼠98只，雌雄兼用，体质量(20±2)g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK桂2014-002。
1.1.2药物与试剂 TF由广西中医药大学中药化学教研室提供；秋水仙碱购自北京索莱宝科技有限公司(批号：505A0316)；金龙鱼花生油(批号：20151029)，四氯化碳(CCl4)购自广东西陇化工厂(批号：20150511)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(批号：20160725)；天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(批号：20160723)，均购自南京建成生物科技有限公司。Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)试剂盒(批号：201606)，Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)试剂盒(批号：201606)，转化生长因子-β1(TGF-β1)试剂盒(批号：201608)，均购自美国R&D公司。兔单克隆抗体α-SMA Lot：GR212262-19，兔多克隆抗体TGF-β1 Lot：GR121841-15，兔单克隆抗体Smad2 Lot：GR269028-1，兔单克隆抗体Smad3 Lot：GR169548-20，兔单克隆抗体Smad4 Lot：GR261313-2，兔单克隆抗体Smad7 Lot：GR241822-21，均购自美国abcan公司。MaxVisonTM试剂盒(批号：160912409C)购自福州迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂盒(批号：K165920D)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.3实验仪器 EPOCH型酶标仪购自美国BIO-TEK公司，ST16型离心机购自美国Thermo Fisher公司，BP211D型电子天平购自德国赛多利斯公司，明澈-D24UV型超纯水仪购自法国默克密理博公司，Donatello型自动组织处理机购自意大利Diapath.S.p.A公司，Shandon Histocentre 3型组织包埋机购自美国Thermo Fisher公司，RM2235型 组织切片机购自德国Leica公司，YT-7FB型生物组织摊烤片机购自亚光医用电子技术有限公司，DM2500型 显微镜购自德国Leica公司，KK24T18TI型冰箱购自德国SIEMENS公司。
1.2方法
1.2.1动物分组 取昆明种小鼠98只，根据性别采用“均衡随机”方法分为6组，分别为对照组、模型组、秋水仙碱组(0.2 mg/kg)，TF高剂量组(300 mg/kg)、TF中剂量组(150 mg/kg)、TF低剂量组(75 mg/kg)，其中模型组28只小鼠(因前期研究发现模型组小鼠实验过程中会出现死亡的现象)，其余每组14只。除对照组外，其余各组小鼠背部皮下注射25% CCl4花生油溶液，2 mL/kg，每3天1次，连续10周[3]；对照组背部皮下注射等量100%花生油溶液(每3天1次，连续10周)。造模同时对照组和模型组小鼠给予蒸馏水灌胃，其余各组给予相应药物灌胃给药，给药体积为20 mL/kg，每天1次，连续10周。末次给药1 h后摘眼球取血，室温静置1 h后，2 500 r/min离心10 min取上清液，分装于-80 ℃冰箱保存备用。实验结束后，各组小鼠处死，迅速取肝组织，生理盐水洗涤，取部分肝组织剪碎，匀浆，然后转入EP管中，静置，离心，取上清液进行分装，-80 ℃冰箱保存备用，另取肝脏左叶浸入4%甲醛溶液中备用。
1.2.2血清生化指标检测 血清生化指标ALT和AST水平检测严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.3ColⅠ、ColⅢ水平检测 ELISA法检测肝组织中ColⅠ，ColⅢ水平，取分装好的肝组织匀浆，严格按照试剂盒说明书测定肝组织中ColⅠ，ColⅢ水平。
1.2.4免疫组织化学法(IHC)检测 IHC检测肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的表达情况，石蜡切片常规脱蜡后，3% H2O2灭活内源性酶，室温孵育20 min，微波进行抗原修复，10 min后5%牛血清封闭，加兔抗鼠一抗，4 ℃孵育过夜。TGF-β1 1∶250稀释液，Smad2 1∶100稀释液，Smad4 1∶100稀释液，Smad7 1∶100稀释液。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照，二氨基联苯胺(DAB)显色，切片经梯度乙醇脱水干燥(二甲苯透明)，中性树胶封固。IHC切片用Leica DM2500显微镜观察，组织中出现黄褐色为阳性，每张免疫组化切片随机选取5个视野拍照，用ImageJ2x 进行扫描，以平均光密度和阳性染色面积百分比作为蛋白的相对表达水平。
2 结 果
2.1实验动物情况 对照组小鼠皮毛光滑油亮，浓密而有光泽，形态较为丰满，活动迅速灵敏，眼睛灵动明亮，食欲良好；模型组小鼠毛发稀疏，毛色暗黄且无光泽，体型消瘦，活动稍显迟缓，眼睛浑浊，食欲较差。TF低剂量组小鼠被毛稍显暗淡，体型稍偏瘦，行动较对照组小鼠稍迟钝，食欲正常，其肝脏为暗淡的红褐色，被膜欠细腻，质地稍硬，偶见边缘圆钝。TF高、中剂量组小鼠肉眼观察毛发较为浓密，毛色光泽，体型较为丰满，食欲较好，其肝脏为红褐色，被膜较光滑细腻，质地柔软，边缘光整。第9周末随机取模型组、对照组小鼠各2只，解剖观察，制作HE染色，观察发现对照组小鼠肝细胞细胞质饱满，肝细胞沿肝索整齐排列。模型组的两只小鼠肝脏呈灰红色，被膜表面粗糙，质地稍硬，边缘圆钝，肝组织中纤维化明显，有假小叶的形成。病理结果表明肝纤维化模型建立成功。第10周末取指标，实验过程中模型组出现3只小鼠死亡，其中雌性1只，雄性2只。尸检及肝脏HE染色检查，死因均为急性肝衰竭，死亡动物不计入统计学处理。对照组最少动物数为12只，其他各组根据性别采取“均衡随机”方法随机测量12只小鼠肝纤维化相关指标，以便后期更好分析。
表1 各组小鼠血清ALT，AST活性及肝组织中ColⅠ，ColⅢ水平比较
a：P<0.05，与对照组比较；b:P<0.05，与模型组比较；c:P<0.05，与秋水仙碱组比较
表2 各组小鼠肝脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7、α-SMA蛋白平均光密度比较
a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较；c：P<0.05，与秋水仙碱组比较
A:对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：TF高剂量组；E：TF中剂量组；F：TF低剂量组
图1 显微镜下各组小鼠TGF-β1蛋白在肝细胞中的表达(IHC，×400)
a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较；c：P<0.05，与秋水仙碱组比较
A:对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：TF高剂量组；E：TF中剂量组；F：TF低剂量组
图2显微镜下各组小鼠Smad2蛋白在肝细胞中的表达(IHC，×400)
A:对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：TF高剂量组；E：TF中剂量组；F：TF低剂量组
图3显微镜下各组小鼠Smad4蛋白在肝细胞中的表达(IHC，×400)
2.2各组小鼠肝功能指标及肝组织中ColⅠ、ColⅢ水平比较 模型组、秋水仙碱组、TF高、中、低剂量组小鼠血清ALT、AST均高于对照组(P<0.05)，秋水仙碱组、TF高、中剂量组低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但TF改善肝功能效果并不优于秋水仙碱。与模型组比较，TF高、中剂量组及低剂量组ColⅠ，ColⅢ水平明显降低(P<0.05)，见表1。
A:对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：TF高剂量组；E：TF中剂量组；F：TF低剂量组
图4显微镜下各组小鼠Smad7蛋白在肝细胞中的表达(IHC，×400)
A:对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：TF高剂量组；E：TF中剂量组；F：TF低剂量组
图5显微镜下各组小鼠α-SMA蛋白在肝细胞中的表达(IHC，×400)
2.3各组小鼠肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7、α-SMA蛋白表达水平比较 TGF-β1蛋白IHC结果显示，对照组小鼠TGF-β1在肝脏组织中表达较少，模型组中可见广泛表达于肝细胞细胞质及汇管区增生的纤维细胞细胞质中；秋水仙碱组在肝细胞细胞质中仍有较明显表达，但与模型组相比有明显地减少；TF高、中、低剂量组TGF-β1在肝细胞细胞质中的表达与模型组相比均有所减少，其中TF中剂量组的减少更为明显(P<0.05)，见图1。Smad2蛋白IHC结果显示，对照组小鼠Smad2仅少量表达于细胞核中；模型组可见广泛表达于细胞核中；秋水仙碱组Smad2在肝细胞核中表达与模型组相比有所减少；TF高、中、低剂量组Smad2在细胞核膜中的表达与模型组相比均有所减少，其中TF高、中剂量组中减少更为明显，见图2。Smad4蛋白IHC结果显示，对照组较少地表达于细胞核核膜；模型组中可见Smad4广泛地表达于大部分细胞核核膜中；秋水仙碱组在肝细胞核中的表达与模型组相比有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05);TF高、中剂量组在肝细胞细胞核及核膜中的表达与模型组相比均有所减少，其中TF高剂量组减少更为明显(P<0.05)，见图3。Smad7蛋白IHC结果显示，对照组小鼠较多地表达于细胞质和细胞核核膜；模型组较少地表达于细胞核核膜中，细胞质中表达的更少；TF高剂量组与模型组平均光密度比较差异有统计学意义(P<0.05);秋水仙碱组及TF中、低剂量组在肝细胞细胞质和细胞核核膜中表达与模型组相比均有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05);蛋白阳性表达面积结果显示，TF高、中、低剂量组与模型组相比表达量均明显增加，其中TF高剂量组增加的更为明显，见图4。α-SMA蛋白IHC结果显示，对照组仅少量地表达于血管壁；模型组中α-SMA大量表达于肝门静脉及假小叶的纤维间隔区域；秋水仙碱组少量地表达于门静脉及汇管区；TF高、中、低剂量组与模型组相比蛋白平均光密度均明显降低(P<0.05)；蛋白阳性表达面积结果显示，TF高、中、低剂量组与模型组相比均明显性降低，其中TF高剂量组减少更为明显(P<0.05)，见图5。各组小鼠肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7及α-SMA蛋白表达水平比较，见表2、3。
3 讨 论
本课题组前期对TF的药理药效进行了广泛的研究，发现其具有抗炎、保肝降酶、抗病毒、抗肿瘤等作用[2-3]，TF保肝降酶、抗肝纤维化的研究集中在药理药效，其作用机制仍不清楚[4-7]。本研究采用CCl4复制小鼠肝纤维化模型，具有成模率高，病变典型等特点。其机制为CCl4经肝微粒体的细胞色素P450代谢生成的三氯甲基自由基攻击细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化，三氯甲基自由基继而与细胞膜脂质和蛋白大分子进行共价结合，引起膜结构和功能完整性的破坏[8]。ALT、AST存在于机体的脏器和组织中，ALT水平从高到低分布的次序大致为肝、肾、心、肌肉；AST水平从高到低分布的次序大致为心、肝、肌肉、肾。在肝脏ALT主要分布在细胞质内，AST则分布于细胞质和线粒体中。肝组织中的细胞外基质(ECM)主要含有ColⅠ、ColⅢ，两种胶原蛋白的占比变化反映着肝纤维化的病情发展情况。肝脏在损伤过程的同时，激活了一系列的应激反应，肝纤维化相关的细胞因子的合成和释放增加，其中TGF-β1是与肝纤维化的形成最为密切的细胞因子之一[9-10]。肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化的核心环节，活化的HSC增大、增殖，维生素A水平降低，表型发生改变并大量表达α-SMA作为骨架蛋白。活化的HSC由过渡型最终转化为成纤维类的肌成纤维细胞，使得胶原蛋白的合成增加降解减少[11]。TGF-β1能够激活HSC，促进肝脏胶原蛋白的合成，抑制ECM的降解，导致肝脏纤维化形成。
TGF-β1是TGF-β超家族中的一员，哺乳动物TGF-β分为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3种，其中TGF-β1在肝脏中水平最高且具有生物活性，肝脏损伤时HSC是TGF-β的主要来源。TGF-β受体(TBR)同样存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种类型，其中Ⅰ型和Ⅱ型为丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶，其和TGF-β1的亲和力比TGF-β2的亲和力强。TβRⅡ在细胞质内具有Ser/Thr激酶区，其细胞外端首先与配体结合，细胞内段的Ser/Thr激酶被活化，被配基耦合的TβRⅡ使Ⅰ型受体近膜区GS结构域磷酸化，进而将生物信号向细胞内转导[12-13]。 TβRⅢ无激酶活性，主要作用是调节TβRⅡ的膜上表达及配体与受体的亲和力，不直接参与TGF-β1/Smad细胞信号通路传递。TGF-β1是TGF-β1/Smad信号转导通路中的启动因子，TGF-β1连续激活TβRⅡ、TβRⅠ，TβRⅠ使质-核信号分子Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4结合，以R-Smad-Smad4三聚体的形式进入核内，最终与染色质形成核复合物，调控基因表达。Smad最初在果蝇中发现，统称为Smads蛋白家族。脊椎动物中Smad成员，分为3类，(1)受体激活的Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8亚型。(2)通用型Smad(Co-Smad),目前只有Smad4。(3)抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6、Smad7，其能与受体结合但C端功能区缺乏磷酸化位点，并且缺少MH1功能区无法与染色质有效结合，是信号转导中的抑制因子，竞争性抑制R-Smad与TβR结合[14]。TβRⅠ-SA RA-Smad复合体形成后，TβRⅠ激酶将Smad蛋白C端MH2上SSXS基序中色氨酸磷酸化，从而使Smad2/3活化，Smad2/3继而与TβR及SARA解离，同时与Smad4形成杂聚体，进入细胞核，调节转录。 TGF-β1/Smad通路通过与C-Jun/C-Fos及P300/CBP等基因转录调节因子的协同作用激活胶原酶Ⅰ等胶原相关基因的转录[15-16]。STRAP蛋白可与TβRⅠ、Ⅱ连接，又与Smad7特异性聚合并将其运送至活化的TβRⅠ，使TβRⅠ-Smad7复合体形成及稳定，从而阻止Smad2、3与受体结合。
本研究结果显示，与模型组比较，TF通过抑制肝纤维化小鼠肝组织中TGF-β1的过表达，从而抑制HSC的激活，进而阻断肝纤维化的发展，使肝组织炎症、胶原纤维增生情况明显减轻。IHC结果显示，其中TF高、中、低剂量均能不同程度下调肝脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白的表达，并能上调Smad7蛋白的表达。TF下调肝脏组织中α-SMA蛋白的表达，抑制ColⅠ，ColⅢ的合成，促进ECM的降解。
综上所述，TF可能是通过调控TGF-β1/ Smad信号通路中相关蛋白的表达，从而发挥抗肝纤维化的作用。
