牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/IL-15经鼻黏膜免疫SD大鼠的实验研究*

曾凤娇，杨 琳，刘建国，于 航，陈 靖，白国辉

(1.遵义医科大学口腔学院，贵州遵义 563000；2.贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室,贵州遵义 563000；3.贵阳市口腔医院综合科 550000)

牙周病以其较高的发生率及危害性影响着1/3成人及超过1/2的65岁以上老年人的牙齿健康，同时与全身的一些系统性疾病也有一定关系。因此，探寻一种能够有效预防和治疗牙周病的方法对解决牙周病带来的各种危害有着重要的现实意义。研究认为，牙周病是由寄生菌以菌斑生物膜为主要的存在形式，寄生于口腔及局部微生态环境，使一些厌氧致病菌滋生、定植并破坏宿主的细胞结构引起的[1]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.g) 利用补体系统诱发菌群及微环境失调，破坏宿主的防御系统而引发病变，目前普遍认为对于慢性牙周病具有明确的致病作用[2]。P.g黏附定植于宿主细胞，是发挥破坏作用的基础。P.g表面含有菌毛、牙龈素、脂多糖、外膜蛋白、血凝素和蛋白酶等大量毒力因子，其中表面重要的致病因子菌毛和牙龈素在P.g的黏附和定植中起重要作用。菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)作为菌毛主要的亚单位，是菌毛发挥黏附作用的重要因子。在口腔环境中，FimA可通过与宿主细胞外部分子特异性地结合来促进细菌的定植，以及与牙菌斑内其他菌体表面蛋白相结合进一步促进菌斑生物膜成熟而发挥致病作用。牙龈素作为特异性半胱氨酸蛋白酶，编码基因分别为rgpA、rgpB和kgp。其中rgpA基因包括血凝集素黏附结构域(hemagglutinin A，HA)和催化结构域。HA基因又分为编码HA1～4结构域的4段，其中HA2为P.g的关键区域。有文献显示菌毛的表达可影响牙龈素的合成，而牙龈素亦可通过其蛋白水解活性影响菌毛的成熟，二者在黏附过程中可能是协同发挥作用[3]。因此，本实验选择联合使用FimA和牙龈素抗原基因构建的基因疫苗作为免疫原,通过黏膜免疫的方式作用于SD大鼠，观察其对于SD大鼠牙周炎产生的免疫防御作用。本实验组前期已经成功制备了牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/白细胞介素(IL)-15[4]。并证实目的基因HA2、FimA在mRNA水平能够被正确表达，以及制备了相应的蛋白抗原，应用聚合酶链反应(PCR)、Western blot、酶联免疫吸附实验(ELISA)等证实目的基因在体外能够被正确表达。本次实验在前期基础上，通过牙周炎基因疫苗经鼻黏膜免疫SD大鼠后，检测唾液中相关的特异性抗体水平变化，观察该基因疫苗的免疫原性。初步探索牙周病基因疫苗免疫防治牙周病的机制及可行性，同时为下一步牙周炎基因疫苗的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 7周龄的SD雌性大鼠32只，体质量150 g左右，购自第三军医大学野战外科研究所动物室。质检单位：重庆市实验动物质检中心。许可证号：SCXK (渝)2012-0005。

1.1.2重组质粒及主要试剂 牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/IL-15，空载体pVAX1，HA2、FimA抗原为课题组前期构建和保存。Goat anti-Mouse IgA Cross-Adsorbed(Thermo公司,美国)；牛血清清蛋白(BSA,Amresco公司，美国)；Secondary Antibody,辣根过氧化物酶标记的单抗大鼠IgA(基因有限公司，中国)；戊巴比妥钠(哈灵生物科技有限公司，中国)；2%硝酸毛果芸香碱(山东正大福瑞达制药有限公司，中国)。

1.2方法

1.2.1主要试剂配制 ELISA相关试剂配置详见参考文献[5]。

1.2.2实验动物分组与免疫 32只7周龄雌性SD大鼠平均分组，每组8只。实验组：A、B组，对照组：C、D组。具体如下：A组pVAX1-HA2-FimA组；B组pVAX1-HA2-FimA/IL-15组；C组pVAX1组；D组生理盐水组。在第0、7、14天对大鼠进行牙周炎基因疫苗免疫，免疫途径为双侧鼻黏膜免疫。免疫剂量为200 μg·次-1·只-1(1 μg/μL)，免疫次数为3次。

1.2.3标本采集 唾液标本采集时间：免疫前1 d及免疫后每周，连续收集9周。采集方式：腹腔注射药物，2%硝酸毛果芸香碱(0.3 mL/100 g)，约1 min后开始收集唾液，每只收集量约0.5 mL。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，弃杂质沉淀，-80 ℃保存备用。

1.2.4唾液中分泌型IgA(sIgA)抗体水平检测 采用间接ELISA法。以交叉连续稀释分析法确定出酶标抗体过氧化酶标记羊抗大鼠IgA最佳工作比例为1∶4 000,HA2、FimA抗原最佳包被浓度为2.5 μg/mL；唾液标本最佳稀释比例1∶4。按浓度梯度包被96孔酶标板，5% BSA封闭，每孔加入100 μL唾液标本[含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)1∶4稀释]。37 ℃湿盒温育2 h，加入100 μL辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgA抗体(二抗，1∶4 000),加入底物显色，酶标仪检测记录450 nm处吸光度(A450)值。

1.2.5免疫部位目的蛋白的表达的检测 免疫后第5周每小组取2只大鼠处死，分离鼻黏膜，固定、包埋，5 μm连续切片,免疫组织化学检测。先进行抗原修复(HA2：0.01 mol/L柠檬酸缓冲液，加热10.5 min；FimA：0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液，加热12.0 min)。所用抗体如下：一抗为根据预实验确定的HA2、FimA(1∶200)，阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，4 ℃过夜；二抗为HRP标记的第二抗体，37 ℃ 20 min。二氨基联苯胺(DAB)染色液显色，常规透明、脱水和封片。

2 结 果

2.1唾液中特异性抗体检测唾液中sIgA型抗HA2抗体水平的观察 第1周开始，实验组抗体即产生，2～5周逐步上升，第5周达到高峰；抗体水平从第6周开始下降，第9周逐渐接近免疫前水平。对照组维持较低抗体水平且起伏变化不明显。B组免疫诱导的唾液sIgA型抗HA2抗体水平比A组高，第8周A组抗体水平接近免疫前，而B组在第9周表现出此现象(图1、表1)。

2.2唾液中sIgA型抗FimA抗体水平的观察 免疫第1周，实验组抗体水平出现升高，2～5周逐步上升，于第5周达到高峰。第6周开始，抗体平逐渐下降，其中A组下降速度较明显，第9周抗体水平与免疫前接近。C组及D组维持较低抗体水平且起伏变化不明显。B组免疫诱导的唾液sIgA型抗FimA抗体水平较A组高(图2、表2)。

图1 大鼠唾液中sIgA型抗HA2抗体水平趋势图

图2 大鼠唾液中sIgA型FimA抗体水平趋势图

表1 各组SD大鼠唾液中sIgA型抗HA2抗体A450值组间比较P值

表2 各组SD大鼠唾液中sIgA型抗FimA抗体A450值组间比较P值

A：pVAX1-HA2-fimA组；B：pVAX1-HA2-fimA/IL-15组；C：pVAX1组；D：生理盐水组

图3HA2蛋白免疫组织化学定位(×400)

A：pVAX1-HA2-FimA组;B：pVAX1-HA2-FimA/IL-15组;C：pVAX1组;D：生理盐水组

图4FimA蛋白免疫组织化学定位(×400)

2.3鼻黏膜目的蛋白的表达 HA2蛋白在鼻黏膜固有层中黏液性腺泡、腺体及部分巨噬细胞质内见棕黄色目的蛋白的表达，阳性染色在对照组没有出现(图3)。FimA蛋白在鼻黏膜固有层中黏液性腺泡、腺体、骨骼肌、部分巨噬细胞质及细胞间质中见棕黄色目的蛋白的表达，阳性染色在对照组没有出现(图4)。

3 讨 论

自从明确了P.g在牙周炎中产生的影响以来，利用P.g毒力因子的抗原开发相关牙周病疫苗一直为该领域研究热点。有研究用基因疫苗pCTLA4-fimA免疫小鼠，观察到血清中特异性抗体IgG，唾液中特异性抗体IgA增强，小鼠牙槽骨水平与免疫前相比吸收程度降低[6-7]。GIBSON等[8]也认为rgpA基因疫苗较rgpB能更有效地抑制牙槽骨吸收。研究发现在牙周炎患者的血清和龈沟液中存在P.g的特异性抗体,特异性抗体与疾病严重程度相关[9]，表明宿主的防御机制发生了激活，虽然其产生抗体不能完全消除P.g的感染，但这也提示可以通过开发针对P.g的基因疫苗去预防P.g诱导的牙周炎。

黏膜免疫作为人体的第一道防线，可以提供高效的保护作用。然而，大多数商业疫苗全身输送，只诱导体液免疫保护，而没有病原体特异性黏膜免疫[10]。鼻黏膜滴注免疫方式可以成功诱导体液免疫及黏膜共同免疫，具有无需专业人员操作即可大面积接种,给药方便安全，无痛苦，易接受等特点，对疫苗的推广普及具有重大意义。而且,鼻黏膜的血管及淋巴组织丰富，不规则程度更高,与其他部位黏膜相比更具有渗透性[11]，更有利于抗原的摄取。本实验所使用的牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/IL-15是前期由课题组以FimA与HA2联合，串联细胞因子IL-15所构建。通过对SD大鼠进行免疫观察发现，各实验组特异性抗体水平均较对照组及免疫前水平高，在免疫第5周抗体水平达到高峰。这可能与以鼻黏膜免疫作为免疫途径，从而诱导机体产生了体液免疫应答及黏膜共同免疫系统的免疫应答的效应有关。

黏膜免疫反应和口腔中防御病体入侵的主要免疫球蛋白均为sIgA。sIgA主要来源于黏膜中的B1细胞，IL-15可以特异性地作用于被抗原致敏的B1细胞，诱导并促进其增殖[12]。国内有学者也证明IL-15对于基因疫苗产生的免疫反应是有正向调节作用的[13]。因此，本实验以检测唾液之中sIgA型特异性抗体的水平作为观察指标，并直接将IL-15基因串联入重组质粒中，避免了免疫操作复杂等问题。在疫苗免疫的过程中，由于免疫原性较弱，常常导致免疫耐受的发生，因而免疫佐剂便被应用于激发较强的黏膜免疫应答。目前黏膜免疫常用的佐剂包括肠毒素(CT)和霍乱毒素(LT),细胞因子也可作为佐剂增强 DNA 疫苗的黏膜免疫效果。本实验中选用IL-15作为免疫佐剂来增强免疫效应，在实验中疫苗免疫组pVAX1-HA2-FimA/IL-15相比免疫组pVAX1-HA2-FimA抗HA2、FimA特异性抗体水平更高，且使用IL-15佐剂免疫组抗体下降程度稍缓，这说明IL-15佐剂的使用可能有助于维持抗体高水平的持续时间，可以作为牙龈卟啉单胞菌疫苗的佐剂有效增强抗体的免疫水平。免疫后局部鼻黏膜组织进行免疫组织化学检测目的蛋白，显示在鼻黏膜骨骼肌、巨噬细胞、腺体和腺管内可见FimA的表达，由于其该蛋白为分泌型蛋白，可见其呈现弥散状分布于细胞质及细胞间质中。

本研究表明，以HA2、FimA基因联合的牙周炎基因疫苗能够成功诱导实验大鼠共同黏膜免疫系统产生免疫应答，对于牙周炎的预防有潜在价值。