李 炜，吕钊旭，冯永珍，张淑芝，左语馨，范晶晶,5△

(1.潍坊护理职业学院内科教研室，山东潍坊 261041；2.山东省潍坊市妇幼保健院新生儿科 261000；3.潍坊学院校医院护理部，山东潍坊 261061；4.潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊 261061；5.山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室/潍坊学院，山东潍坊 261061)

哺乳动物妊娠是一个非常复杂的过程，成功的妊娠需要多种分子的协同作用，如类固醇激素、特定生长因子、细胞因子、脂类介质、黏附分子和转录因子等[1]。近年来在胚胎自身和子宫内膜中发现的蛋白质、小分子肽类和一些氨基酸在妊娠过程中起十分重要的作用，其中牛磺酸发挥的作用逐渐引起人们的重视[2-3]。在哺乳动物生殖系统中牛磺酸是含量最丰富的游离氨基酸之一，并且在卵母细胞和着床前的胚胎中都有很高的含量[4-5]。体外培养条件下牛磺酸可以提高兔、小鼠和猪等动物胚胎的桑葚胚率和囊胚率[6-8]。如果在妊娠和哺乳过程中缺乏牛磺酸，后代就会出现生长发育停滞、畸形发育、视网膜退化、心肌损害和中枢神经系统的机能紊乱等现象[9-10]。这些研究提示牛磺酸对于妊娠过程子宫生理作用的正常发挥及胚胎的发育可能起到非常重要的作用。

牛磺酸的多种生物学效应的发挥依赖于它在细胞内的浓度，细胞内牛磺酸来源主要有两种：一种可以通过牛磺酸转运体(TauT)从胞外转运，另一种可以通过细胞内含有的半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)自身合成[11]。CSD是一种同源二聚体酶，属于Ⅱ型脱羧酶家族，其底物为半胱亚磺酸，产物为二氧化碳和亚牛磺酸，现在一般认为CSD是哺乳动物生物合成牛磺酸的主要限速酶[12]。本实验采用免疫组织化学和原位杂交的方法，直观地研究CSD在妊娠早期小鼠子宫和胚胎的表达及定位情况，为研究CSD和牛磺酸在妊娠子宫发挥的生理功能及对胚胎发育的作用等奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 采用8周龄昆明小鼠，控制温度为25 ℃，自然光周期条件下饲养。取发情期雌鼠与雄鼠自然交配，采集妊娠第1～9天着床点与非着床点的子宫组织，4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学。第7天子宫着床点组织、第11天胚胎在10倍体积的4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜，再放入30%蔗糖溶液中浸泡直至组织沉降，取第7天着床点组织用Tissue Tek OCT包埋用于原位杂交，第11天小鼠胚胎进行全胚原位杂交。

CSD多抗由法国TAPPAZ教授(INSERM U 433)赠送，碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG(GAR-AP)、碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(anti-DIG-AP)购自北京中杉金桥公司。Trizol、M-MLV购自美国Promega公司。DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒小提和大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。地高辛标记试剂盒(DIG Oligonucleotide 3′-End Labeling Kit)购自瑞士Roche公司。pMD18-T DNA质粒购自日本TaKaRa公司。乙酰化溶液：10 mL 1 mol/L TEA(pH 8.0)、90 mL焦碳酸二乙酯(DEPC)水、250 μL醋酸酐混匀。Solution B1溶液：100 mL 1 mol/L Tris pH 7.5和30 mL 5 mol/L NaCl用蒸馏水定容至1 L，灭菌室温保存。NBT/BCIP显色液：3.4 μL 100 mg/mL NBT，3.5 μL 50 mg/mL BCIP，2.4 μL 24 mg/mL 左旋咪唑，5.0 μL 10% Tween-20，986.0 μL NBT/BCIP显色液。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色 将石蜡包埋好的子宫组织切成5 μm厚连续切片，找到着床点及胚胎进行免疫组织化学。脱蜡，过梯度乙醇水化，0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液抗原修复，放置至室温，羊血清封闭，按1∶1 000稀释CSD抗体(一抗)滴加在组织上，放入湿盒4 ℃冰箱过夜。第2天洗掉一抗，加入GAR-AP(1∶200)，孵育2 h，NBT/BCIP显色液显色，封片，显微镜照相。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，其他步骤完全相同。

1.2.2原位杂交

1.2.2.1探针制备 针对CSD基因(GeneBank序列号：144942.4)设计实时荧光定量PCR(RT-PCR)引物，正向引物序列为：5′-AGC ACC TCC TCT TCC ATG AG-3′，反向引物序列为：5′-GAT GGC TGA CTC AAA ACC AC-3′。RT-PCR扩增目的基因，纯化回收扩增产物，将产物连接到pMD18-T DNA质粒，质粒转化步骤参考文献[13]方法，重组质粒的酶切及PCR鉴定参考文献[14]方法。酶切、鉴定纯化的质粒DNA分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。线性化后的质粒用DNA凝胶回收试剂盒回收，用紫外分光光度计测定线性化DNA浓度。纯化后的探针使用地高辛标记试剂盒进行标记。

1.2.2.2杂交方法 将包埋好的第7天子宫着床点组织切成10 μm厚的冰冻切片，室温风干30 min，4%四氟乙烯-全氟烷氧基乙烯基醚共聚物(PFA)固定10 min，PBS清洗5 min，乙酰化溶液处理10 min，DEPC水清洗5 min，5 μg/mL蛋白酶K溶液处理5 min，PBS清洗5 min。预杂交液孵育4～8 h，然后用CSD探针杂交液(5 μg/mL)50 ℃孵育过夜。第2天清洗杂交液，牛血清封闭1 h，加anti-DIG-AP(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。次日取出切片用Solution B1室温清洗10 min，NBT/BCIP显色液显色，显色结束终止反应，70%甘油封片并照相。

第11天胚胎从4%多聚甲醛固定，取出，依次通过含100%、95%、75%、50%甲醇PBS溶液，然后放置于PBS中，用10 μg/mL蛋白酶K消化处理20 min，清洗后放入含有0.1%戊二醛的4%多聚甲醛溶液再固定20 min，PBS清洗后，放入65 ℃含有1 μg/mL探针的杂交液中过夜。次日清洗杂交液，用20%胎牛血清封闭1 h，加anti-DIG-AP(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。次日取出放入含1% 牛血清清蛋白(BSA)的PBS-Tween-20(PBST)中清洗，每2小时换液1次，PBST浸泡过夜。次日取出放入PBST中清洗2次，每次30 min，BM purple显色液显色，TE清洗终止显色，解剖镜下照相。正义链探针为阴性对照，原位杂交操作与反义链探针相同。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色结果 免疫组织化学染色结果见图1，蓝色为CSD阳性信号，分布在细胞质中。在妊娠第1、2天子宫中CSD主要定位在子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞，而第3、4天大量子宫基质细胞也表现出较强的CSD阳性。第6天开始胚胎周围的子宫蜕膜细胞不表达CSD，但贴近子宫系膜缘和系膜对侧缘均高表达CSD。第8天开始子宫CSD的表达明显减弱，第9天表达更弱，只有系膜对侧缘子宫CSD呈中等程度阳性反应。在第9天着床点间的子宫CSD主要定位在腔上皮和腺上皮细胞。第4天子宫中的囊胚内细胞团和滋养层细胞都表达CSD，到第9天胚胎都有CSD阳性。阴性对照未检测到阳性信号，见图1。

le:腔上皮;ge：腺上皮；S：基质；myo：子宫肌层；bl:囊胚；em：胚胎；M：系膜缘；Am：系膜对侧缘；IS：着床点；Inter-IS：着床点之间的子宫(标尺为20 μm)

图1CSD在妊娠小鼠子宫中的免疫组织化学分布

em：胚胎；M：子宫系膜缘；Am：子宫系膜对侧缘；IS：着床点；Inter-IS：着床点间的子宫(标尺为100 μm)

图2原位杂交检测CSD的第7天胚胎和子宫定位

2.2原位杂交结果 第7天胚胎和着床点子宫中都能检测到CSD mRNA阳性信号，子宫系膜对侧缘CSD阳性表达明显，胚胎周围的子宫蜕膜细胞未检测到阳性信号。第7天CSD主要定位于腔上皮和腺上皮细胞，阴性对照未检测到阳性信号。第11天CSD定位于脑、心脏、脊髓，见图2、3。

Hb：后脑；T：端脑

图3原位杂交检测CSD的第11天胚胎定位

3 讨 论

雌激素(E2)和孕激素(P4)是胚胎着床过程中最重要的两种激素，E2主要刺激子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞增殖，P4主要刺激子宫内膜基质细胞增殖，并诱导基质细胞分化为蜕膜细胞[15]。本研究结果显示CSD在第1～9天子宫的表达有一定的动态变化，第1～2天主要定位在子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞，第3天开始子宫基质细胞也出现阳性表达。LOBO等[16]用免疫组织化学检测到牛磺酸在发情后期、间情期大鼠子宫的腔上皮细胞和腺上皮细胞表达。子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞具有分泌功能，其分泌物是子宫液的主要来源，本实验结果说明子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞可以通过CSD途径自身合成牛磺酸分泌到子宫液中发挥生理作用，并且可能与E2和P4对子宫细胞的增殖调控有关。妊娠第4～5天被称为小鼠胚胎着床窗口期是妊娠最重要的一个时期，此时的胚胎要受到多种因子的复杂调控才能成功着床[1]。本实验的结果显示从第3天开始大量子宫基质细胞开始表达CSD，CSD表达急剧增加说明可能在着床窗口期子宫需要合成大量牛磺酸，也有可能牛磺酸作为一种信号分子作用于子宫为接受胚胎做准备。从第6天开始胚胎周围的子宫蜕膜细胞中检测不到CSD，第8天子宫CSD的反应明显减弱，第9天表达更弱，只有子宫系膜对侧缘有微弱表达，胚胎从囊胚到第9天胚胎都有CSD阳性。着床过程结束后子宫CSD表达开始下降，可能是由于牛磺酸需求量减少或胚胎通过自身CSD合成的牛磺酸已经能满足发育的需要。CSD的表达模式说明牛磺酸在着床建立以后，可能对胚胎正常发育起一定作用。

原位杂交显示CSD第7天定位于着床点子宫和胚胎中，胚胎周围的子宫蜕膜细胞无表达。第11天定位于胚胎脑、心脏、脊髓。KIM等[17]采用RT-PCR方法也检测到CSD mRNA在ICR小鼠胚胎发育第4、10、15、18天都有表达。STURMAN等[18]发现缺乏牛磺酸的雌猫生下的足月小猫明显比正常猫小，脑质量明显降低，脑形态异常。补充牛磺酸可改善生长受限的胎鼠神经干细胞的增殖[19]。基因敲除牛磺酸转运蛋白引起的牛磺酸耗竭会导致心肌萎缩和心肌病[20]。以上结果说明在胎儿的心血管系统、神经系统等重要系统里是可以通过CSD途径合成牛磺酸，牛磺酸对胚胎重要系统的生长发育发挥一定作用。

综上所述，CSD在妊娠小鼠子宫和胚胎中的表达动态变化，牛磺酸可能在胚胎发育和着床、调节妊娠子宫状态中发挥一定的作用。牛磺酸在胚胎发育过程中的作用及机制仍需进一步研究。