siRNA沉默ARC对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞活力的影响*

张 婕，金 泉，吴素玲，管 明

(1.浙江省杭州市儿童医院内二科 310014；2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院耳鼻喉科 310006)

低氧性肺动脉高压是一种慢性进行性疾病，其中低氧是该病发生的最主要原因。肺动脉血管收缩、肺血管重构及微血管损伤是低氧性肺动脉高压的主要发病机制[1-2]。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)是肺动脉壁的主要构成细胞。PASMCs的增殖和凋亡平衡影响肺血管的厚度，是肺血管重塑的主要机制之一[3]。研究低氧性肺动脉高压的发病机制，寻找更有效安全的治疗方法一直是研究的热点。

含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain,ARC)是一种高效及多功能的调节内外源性凋亡的抗凋亡蛋白[4]。ARC可以拮抗由细胞毒性药物、放射性损伤、氧化应激反应、缺氧、细胞内Ca2+平衡失调、内质网应激等引起的凋亡[5]。由于ARC对于PASMCs生长与肺血管重塑的影响并不明确，本研究主要通过干扰ARC的表达，探讨是否影响下游反应元件的激活，最终通过一系列内外源性抗凋亡因子的表达，使得机体适应外界环境的变化。因此，本研究通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术，体外干扰PASMCs ARC的表达，检测细胞活力变化，讨论ARC在PASMCs生长中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂 胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液购于美国HyClone公司；OPTI-MEM购于美国Gibco公司;青、链霉素(100×)购于上海碧云天生物技术公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购于(H+L)索莱宝公司；FITC标记山羊抗兔IgG购于美国BD公司； BCA蛋白定量试剂盒购于南京维森特生物技术公司；吐温20(Tween-20)购于上海生工生物工程公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购于美国Millipore公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体、β-actin抗体、ARC抗体购于美国Santa Cruz公司;CCK-8购于北京普鲁顿公司。

1.2方法

1.2.1大鼠PASMCs的分离、培养及分组 大鼠PASMCs的培养和鉴定采用胶原酶Ⅰ消化法[9]。取SD大鼠，超净台内处死，取肺组织，分离肺内动脉血管于磷酸盐缓冲液(PBS)中。分离出血管中膜，用眼科剪将血管中膜剪碎，放入预先盛有含0.2%胶原酶Ⅰ的离心管中离心，弃上清液后将沉淀组织重悬于5 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，取细胞悬液，置于培养皿中于培养箱中孵育。一般约1周平滑肌细胞可从组织块中爬出，待细胞即将融合时，进行消化传代，取2～3代细胞进行实验。将PASMCs分成以下4组：常氧组、低氧组、ARC-siRNA+低氧组、Negative-siRNA+低氧组。

1.2.2免疫荧光染色法检测ARC、caspase-3表达 将生长状态良好的PASMCs细胞接种至12孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜后，弃去培养基。取细胞PBS洗涤1次，多聚甲醛固定细胞，室温孵育10 min。PBS洗涤3次，加入含0.2% TritonX-100,室温静置30 min。PBS洗涤3次，加入约40 μL一抗(ARC 1∶1 000、caspase-3 1∶1 000、α-SMA 1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜。除去未结合的一抗，PBS洗涤后加入二抗，静置 30 min， PBS洗涤。随后用DAPI染核5 min，PBS洗涤，用尖镊子将玻片取出，晾干，载玻片上滴一滴封片液。荧光显微镜下观察，拍照。

1.2.3siRNA转染细胞 PASMCs接种于6孔板中，待细胞长至70%融合时，弃培养基，用PBS洗3次，无血清培养基洗2次，加入新的无血清培养基，将Lipofectamine2000、ARC-siRNA(ARC-siRNA 1、2、3)或阴性对照序列(Neigative-siRNA)分别加入细胞中，充分混匀，培养48 h后，换液，进行后续实验。ARC的3个siRNA oligo序列见表1。

表1 各siRNA序列

1.2.4CCK-8法检测细胞活力 收集细胞，将转染48 h的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，稀释细胞使其浓度为3×107/L。分别取100 μL于96孔板培养，每组设3个复孔，常氧培养过夜贴壁。在常氧或低氧条件下将各组细胞分别培养 0、24、48、72 h后，按1∶10体积比混合CCK-8和无血清DMEM培养基，取100 μL加入待测孔中，37 ℃、5% CO2孵育1 h；用微板分光光度计测定450 nm波长下的吸光度(A)值。实验重复3次。

1.2.5Western blot 收集各组细胞，加入细胞裂解液，在冰上静置裂解20 min；4 ℃ 10 000×g 离心5 min,取上清液，加入2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶上样缓冲液水浴(100 ℃)变性10 min，样本备用或分装冻存。取20 μg蛋白样品，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，100 V转移至PDVF膜，封闭液中封闭1 h；加入一抗[分别为ARC抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶500)]室温孵育2 h；洗膜；放入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG室温孵育1 h；PBST洗膜，在暗室中加ECL发光试剂，X射线胶片曝光1～2 min后显影、定影，杂交信号在图像分析系统中进行光密度扫描。应用管家基因β-actin作为内参，其余目的蛋白与其的比值对目的蛋白相对表达水平。实验重复3次。

表2 各基因RT-PCR引物

1.2.6RT-PCR TRIzol一步法提取各组细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书步骤，合成cDNA。紫外吸收法测定总RNA在260 nm和280 nm处A值，计算其浓度和纯度。用PCR扩增目的片段。以GADPH mRNA表达水平作为内参。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循环35次。PCR产物在1.5%～1.8%的琼脂糖凝胶上电泳，条带经紫外显色灰度扫描。各基因RT-PCR引物见表2。实验重复3次。

2 结 果

2.1siRNA在PSCMCs中抑制ARC表达的效率检测 常氧下，免疫荧光染色发现ARC在PSCMCs的细胞核和细胞质内均存在表达，见图1。常氧下，ARC-siRNA干扰后，ARC在PSCMCs中的表达水平经RT-qPCR检测，结果显示：相对于对照细胞(未转染siRNA，常氧，ARC表达水平设为100%),ARC-siRNA1,ARC-siRNA2,ARC-siRNA3作用后，ARC mRNA的表达水平分别为(46.8±3.0)%、(42.6±6.9)%、(50.7±10.0)%，其中ARC-siRNA 2抑制ARC表达的效率最高 (图2A)。Western blot、免疫荧光染色检测ARC-siRNA2干扰，ARC在PSCMCs的表达水平，结果发现ARC在ARC-siRNA2干扰后的细胞中表达较对照细胞显着下降(图2B、C)。因此最终选取ARC-siRNA2来进行后续实验。

图1 ARC在PACMCs中表达(荧光显微镜×800)

A:ARC mRNA表达量被ARC-siRNA1、ARC-siRNA2、ARC-siRNA3转染后所抑制;B:Western blot结果显示 ARC表达水平在ARC-siRNA2干扰后显着下降;C:免疫荧光结果显示ARC表达水平在ARC-siRNA2干扰后显着下降。a:P<0.05

图2ARC-siRNA抑制ARC在PASMCs中的表达(荧光显微镜×400)

2.2ARC对低氧下PASMCs细胞活力的影响 CCK-8法检测细胞活力结果显示低氧明显促进PASMCs活力(P<0.01)，且呈时间依赖性，各组在0 h时A值差异无统计学意义(P>0.05)。在低氧情况下，ARC-siRNA+低氧组的A值较Negative-siRNA+低氧组明显减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3低氧下PASMCs中caspase-3表达水平变化及与ARC的关系 为了进一步研究ARC对低氧下PASMCs活力影响的机制，笔者采用免疫荧光染色检测了caspase-3在低氧作用后表达水平变化。免疫荧光染色结果显示，低氧作用48 h，低氧组caspase-3阳性细胞较常氧组显着增加[(22.4±5.2)%vs.(5.5±1.8)%]。用ARC-siRNA下调ARC表达，再低氧作用48 h，免疫荧光染色结果显示ARC-siRNA组与Negative-siRNA组比较，caspase-3阳性细胞显着增加[(50.1±5.8)%vs. (17.2±4.1)%]。结果表明，ARC干扰后，PASMCs对低氧敏感度增加，可能与caspase-3表达增加有关。见图3。

表3 CCK-8法测量不同分组下PASMCs细胞活力情况值)

a：P<0.05,与常氧组比较；b:P<0.05，与Negative-siRNA+低氧组比较

图3 ARC表达抑制后低氧条件下PASMCs中caspase-3表达水平变化(荧光显微镜×800)

2.4低氧下PASMCs凋亡通路中多种凋亡因子表达水平及与ARC的关系 低氧作用48 h后，低氧组caspase-3 mRNA表达水平较常氧组显着增加，且内源性促凋亡因子Bad、 Fadd表达显着增加，抗凋亡因子Bcl-2表达显着下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。ARC-siRNA+低氧组与Negative-siRNA+低氧组比较，caspase-3和Fadd表达均显着增加，Bcl-2表达则显着下降(P<0.05)，而Bad表达无明显变化(P>0.05)，见图4。

a：P<0.05,与常氧组比较；b:P<0.05 ，与Negative-siRNA+低氧组比较

图4ARC表达抑制后低氧条件下凋亡因子表达水平变化

3 讨 论

低氧性肺动脉高压是由低氧血症引起的肺动脉压力升高，是一种慢性进行性疾病，其主要病理特征为肺动脉压力持续增高、肺动脉壁的增厚及血管肌化，目前其治疗手段和效果有限，预后极差，常导致患者右心心力衰竭而死亡[1]。其中低氧是该病发生的最主要原因。肺动脉血管收缩、肺血管重构及微血管损伤是低氧性肺动脉高压的主要发病机制[2]。低氧性肺血管重建是低氧性肺动脉高压的主要病理改变，PASMCs是构成肺动脉壁的主要细胞，PASMCs增殖和凋亡失衡是肺血管重塑的主要机制，而细胞活力的变化能从侧面说明反映细胞增殖凋亡情况。

ARC是1998由KOSEKI等[4]首次发现并命名是一种高效及多功能的调节内外源性凋亡途径的抗凋亡因子。ARC含有两个功能区域：CARD和P/E，CARD区同凋亡因子caspase的CARDS区及凋亡受体蛋白RAIDD和Apaf-1具有同源性。ARC通过与caspase或其受体蛋白之间的相互作用来调节凋亡信号，维持其线粒体膜电位的稳定，抑制线粒体释放活性氧[5]。在心肌细胞缺血再灌注模型中，ARC缺陷的小鼠，心肌细胞损伤更加显着[6-7]。而过表达ARC可保护心肌因缺血再灌注引起的损伤[8-9]。ARC参与细胞程序性死亡、凋亡、迁移等行为的调控，维持线粒体膜电位的稳定[5,10-13]。

本研究发现ARC在PASMCs表达，对于低氧性肺动脉高压研究显示，低氧促进PASMCs活力，凋亡减少，增殖增加[14]，在肺血管重塑中发挥着重要作用，这与本研究的研究结果相符。本研究用转染法将外源性siRNA导入PASMCs构建ARC干扰模型，在经过体外转染PASMCs并做筛选后，选定转染效率最好的靶点2(ARC-siRNA2)，采用免疫荧光来检查转染结果，结果显示ARC表达显着降低，说明转染模型构建成功。研究结果显示ARC对PASMCs活力可能具有一定的增强作用，低氧下PASMCs细胞活力较常氧下增加。低氧下，当ARC受到抑制时，细胞活力受抑制；本研究显示这一结果可能与多种因子相互作用有关，当ARC表达被抑制时，促凋亡因子caspase-3和Fadd表达显着增加，抗凋亡因子Bcl-2的表达降低，而促凋亡因子Bad无明显变化。