马彦娟，任 芳，李 闯，陈希妍，杨 平，石金河
(新乡医学院第一附属医院急诊科，河南卫辉 453100)
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种严重的心脏疾病，是由于急性冠状动脉闭塞后导致的缺血缺氧而引起的心肌细胞死亡[1]。目前，大量研究表明在AMI心肌细胞功能受损和心力衰竭中，炎症和心肌细胞凋亡发挥重要作用[2]。miRNA是一类非编码的长度为19～25个核苷酸的短链RNA，其在细胞的多种功能调节，如分化、增殖、转移和凋亡等中发挥着重要作用[3]。研究显示miRNA-124在AMI患者血清中的表达升高[4]，下调miRNA-124-3p可通过抑制心肌细胞凋亡而发挥对心肌梗死的保护作用[5]。还有研究表明，Wnt信号通路参与调节大鼠心肌梗死模型中的细胞凋亡[6]。miRNA-124-3p是否可通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥心肌细胞凋亡保护作用的研究还未见报道。本研究以H9C2细胞为研究对象，检测缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型中miRNA-124-3p抑制剂在调控Wnt/β-catenin信号通路中及细胞凋亡的可能作用，为心肌细胞缺血缺氧的治疗提供参考，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)；Wnt1 siRNA、阴性对照(negative control，NC)siRNA(美国SANTA Cruz公司)；miRNA-124-3p抑制剂(上海吉玛基因公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；Wnt1抗体、β-catenin抗体、p53抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体(美国SANTA Cruz公司)；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗体(美国Abcam公司)；GAPDH抗体(美国Sigma公司)；荧光Ⅱ抗(美国LI-COR公司)。
1.2 方法
1.2.1H9C2的培养
大鼠心肌细胞H9C2细胞株(协和细胞库)培养于高糖DMEM培养基(内含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及0.1 mg /mL链霉素)，37 ℃、5% CO2恒温培养箱，2～3 d传代1次。
1.2.2OGD模型的建立及实验细胞分组
正常条件下培养的对数生长期的H9C2细胞，更换成无血清低糖DMEM培养基，1% O2、94% N2、5% CO2恒温培养箱培养48 h，形成OGD模型。细胞分为正常对照组、OGD组、NC-siRNA组(转染NC-siRNA后OGD条件培养48 h)、miRNA-124-3p抑制剂组(转染miRNA-124-3p抑制剂后OGD条件培养48 h)和Wnt1 siRNA组(转染Wnt-1 siRNA后OGD条件培养48 h)。
1.2.3心肌细胞转染
利用Lipofectamine2000转染试剂分别将miRNA-124-3p抑制剂、Wnt1 siRNA与NC-siRNA转染至H9C2细胞。
1.2.4心肌细胞活性的检测
将H9C2接种于无菌的96孔板中，密度为5×103个/孔，按照1.2.2方法将细胞分为5组，在OGD培养48 h后检测各组细胞活性，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培养条件下继续孵育3 h，酶标仪450 nm处测光密度(A)值。
1.2.5Western blot
利用RIPA裂解液提取5组细胞总蛋白。常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳及转膜后，室温条件下封闭膜1 h(利用5%脱脂奶粉)，分别用Wnt1抗体(1∶1 000)、β-catenin抗体(1∶1 000)、p53 抗体(1∶500)、Bax抗体(1∶500)、Bcl-2抗体(1∶500)、cleaved-caspase-3抗体(1∶1 000)及GAPDH抗体(1∶10 000)4 ℃条件下孵育膜过夜(12 h以上)，室温避光条件下荧光Ⅱ抗(1∶1 000)孵育2 h，利用Odyssey曝光，Image J软件分析灰度值。
1.2.6ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6及IL-1β的水平
收集上述5组细胞的培养液，2 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液，采用ELISA法测定各组细胞培养液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平。
1.3 统计学处理
2 结 果
2.1 miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA对Wnt1及β-catenin表达的影响
Western blot结果显示，与NC-siRNA组比较，miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组心肌细胞Wnt1及β-catenin表达水平明显降低(P<0.05)，而NC-siRNA组与OGD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、2。
1：正常对照组；2：NC-siRNA组；3：Wnt1 siRNA组；a：P<0.01，与NC-siRNA组比较。
1：正常对照组；2：NC-siRNA组；3：miRNA-124-3p抑制剂组；a:P<0.05，与NC-siRNA组比较。
2.2 各组心肌细胞活性比较
CCK-8结果显示，正常对照组心肌细胞的活性较高，而OGD组心肌细胞的活性明显降低(P<0.05)；与OGD组比较，miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组细胞活性明显升高(P<0.05)，而miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组细胞活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。
2.3 各组p53、Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3蛋白表达水平比较
与正常对照组比较，OGD组p53、Bcl-2蛋白表达水平降低，而Bax及cleaved-caspase-3的表达水平升高(P<0.05)。与OGD组比较，miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组p53、Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax及cleaved-caspase-3表达水平降低(P<0.05)，而miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。
2.4 各组TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较
与正常对照组比较，OGD组TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05)；与OGD组比较，miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组TNF-α、IL-6及IL-1β水平明显降低(P<0.05)，而miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
1：正常对照组；2：OGD组；3：NC-siRNA组；4：miRNA-124-3p抑制剂组；5.Wnt1 siRNA组；a：P<0.05。
表1 各组TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较
3 讨 论
AMI是当前临床上常见的缺血性心脏病之一，其发病机制较为复杂，研究表明炎症和心肌细胞凋亡参与介导心肌功能受损和心力衰竭，在AMI的发病机制中发挥重要作用[2,7]。
Wnt通路是一种进化保守的信号转导通路，在个体发育和成人期调控着多种细胞功能。AMI发生后，Wnt信号通路通常会被激活，因此，通过抑制Wnt信号通路的激活或可成为一种减轻或修复AMI所引起的心肌细胞损伤的有效策略[8-9]。
MiRNA是一类非编码短链RNA，多种miRNA在心肌细胞的损伤中及AMI的治疗中发挥着重要作用[10-11]。MAYORGA等[12]研究表明Wnt/β-catenin信号通路及miRNA-145参与AMI发展的调节。SUN等[6]研究显示miRNA-154通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与调节心肌梗死大鼠心肌细胞的凋亡。miRNA-34a通过调节Wnt/β-catenin信号通路的激活，调控AMI所引起的细胞凋亡[13]。作为miRNA家族的成员之一，miRNA-124-3p也在细胞的增殖与凋亡中发挥着作用[14-15]。BAI等[16]研究显示，CircHIPK3与miRNA-124-3p 结合可抑制心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞增殖能力和诱导凋亡，下调miRNA-124-3p可通过抑制心肌细胞凋亡而发挥对心肌梗死的保护作用[5]。然而，miRNA-124-3p的作用机制并不明确，在OGD条件下，抑制miRNA-124-3p与Wnt/β-catenin信号通路及细胞凋亡之间的关系，还未见报道。
本实验结果显示，利用OGD模型转染miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA至心肌细胞后，Wnt1 siRNA可有效敲低模型心肌细胞Wnt1与β-catenin的表达，而miRNA-124-3p抑制剂同样可有效敲低模型心肌细胞中Wnt1与β-catenin的表达，说明miRNA-124-3p对其有一定的调节作用；与OGD组细胞相比较 miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA可提高OGD组中心肌细胞的活性，且二者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
为了检测miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA在心肌细胞凋亡中的作用机制，本课题组利用Western blot 检测了各组细胞凋亡相关蛋白的表达，与正常对照组相比较，OGD组细胞中p53、Bcl-2蛋白的表达均明显降低，Bax及cleaved-caspase-3的表达明显升高；而与OGD组比较，miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt-1 siRNA组细胞中p53、Bcl-2蛋白的表达明显升高，Bax及cleaved-caspase-3的表达明显降低，且两组p53、Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3蛋白水平比较，差异无统计学意义(P<0.05)，ELISA结果显示转染miRNA-124-3p抑制剂及Wnt1 siRNA后，细胞中TNF-α、IL-6及IL-1β水平均明显降低，且二者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。说明miRNA-124-3p抑制剂对OGD的心肌细胞有一定的保护作用。
综上所述，miRNA-124-3p抑制剂可通过抑制Wnt1与β-catenin的表达来抑制Wnt信号通路的激活，进一步抑制心肌细胞的凋亡，减轻细胞损伤，减少炎性因子的释放，对OGD的心肌细胞起到保护作用。可为临床心肌细胞缺血缺氧的治疗提供参考。
