李 丽，刘金柱
(天津市儿童医院/天津大学儿童医院麻醉科 300101)
睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)是指由于各种原因引起的机体睡眠不足，可导致患者出现焦虑烦躁、心脑血管意外、免疫功能下降、抑郁自杀等症状[1]。近年来，SD也逐渐成为临床研究热点之一[2]。有研究发现，连续SD可导致甲状腺功能受损，并引起机体各个系统、器官、组织功能异常[3-4]，而甲状腺可维持机体各系统、器官和组织的正常功能[5]，故研究SD过程中甲状腺细胞的功能状态，对阐明SD机制和改善SD患者身心健康，具有一定的潜在意义。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路可调控细胞生长、增殖、分化及凋亡等多种细胞生理活动，且参与甲状腺癌、甲状腺功能减退等病理过程，是近来研究的热点通路之一[6-7]。然而，PI3K/Akt通路在SD过程中的调控作用，研究却相对较少。丙泊酚为短效静脉麻醉药，具有镇静催眠作用，有研究显示，丙泊酚可参与协调大脑皮质交流和运行，并改善睡眠障碍患者的睡眠状况[8]。然而丙泊酚是否能够通过影响SD患者甲状腺功能，缓解睡眠不足引起的机体功能异常及不适症状，还未见报道。本研究建立SD大鼠模型，探讨丙泊酚对SD大鼠甲状腺功能及PI3K/Akt通路的影响，以期阐明丙泊酚改善SD患者睡眠障碍的其他可能生物学机制，为临床合理用药提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1动物
清洁级同遗传背景雄性Sprague Dawley大鼠购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(粤)2018-0002。所有大鼠于天津医科大学动物中心饲养，实验室许可证号为SYXK(津)2004-0001。饲养条件：自然光照，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%，噪音低于80分贝，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本实验经医院伦理委员会批准，实验动物符合3R原则。
1.1.2主要试剂及仪器
丙泊酚购自北京凯瑞基生物科技有限公司(货号：CY19852，规格：100 mg)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(货号：G1120)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche公司(货号：11684795910)；PI3K抗体、磷酸化Akt(p-Akt)抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗体、B细胞白血病2(Bcl-2)抗体购自美国Abcam公司(货号分别为：ab39307、ab38449、ab140882、ab196495)；BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶购自美国Pierce公司(货号分别为P0768、P0231)。手动轮转式切片机购自德国Leica公司(型号RM2125RTS)；光学显微镜购自日本尼康公司(型号SMZ745)；蛋白电泳仪、半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司(型号1659001、Trans-Blot SD)；凝胶成像仪购自杭州米欧仪器有限公司(型号GIS-500)。
1.2 方法
1.2.1大鼠SD模型建立及分组
选取大鼠50只分为正常组(Normal组)、SD模型组(SD组)、丙泊酚低剂量组(10 mg/kg)、丙泊酚中剂量组(25 mg/kg)、丙泊酚高剂量组(50 mg/kg)，每组10只。Normal组在正常条件下持续光照12 h+黑暗12 h模拟正常睡眠，其余各组大鼠均参照文献[9]建立SD模型，具体操作方法：制作30 cm×30 cm×30 cm的玻璃箱，箱中有一直径为6.3 cm、高 8.0 cm 的圆柱体平台，在平台周边注满水，水温保持约20 ℃，水面距平台面约1.0 cm，将大鼠放到小平台上22 h，并盖上笼盖以防大鼠蹿出，并给予持续日光灯照射，室内温度控制在18.0～22.0 ℃，大鼠在平台上可自行饮食、饮水，若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而落入水中，22 h后将大鼠取离平台，给予正常黑暗环境，让其自由活动2 h后，重新放入小平台中进行SD 22 h，连续21 d后观察大鼠行为状态，若大鼠出现狂躁、易“激惹”及尖叫行为且毛色枯暗现象，表明造模成功。各组均于造模成功后开始给药，丙泊酚参照文献[10]用生理盐水配制成1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL的溶液，按10 mL/kg的剂量经腹腔注射相应剂量的丙泊酚溶液，Normal组及SD组按10 mL/kg的剂量经腹腔注射生理盐水。各组连续给药7 d，每天1次。
1.2.2大鼠一般行为观察
各组大鼠末次给药12 h后，观察毛色、饮食、精神状态等一般行为，并称取大鼠重量。
1.2.3大鼠标本采集
各组大鼠末次给药12 h后，麻醉，取腹主动脉血，全自动免疫分析仪(CLIA)及配套试剂盒用电化学发光法测定血清游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)水平；处死大鼠，取甲状腺，称取重量后，剪取0.5 g组织，置于-80 ℃冰箱保存；其余组织迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，备用。
1.2.4大鼠甲状腺HE染色
4%多聚甲醛溶液中固定24 h的甲状腺组织，经脱水、透明、石蜡包埋后切成4 μm切片，根据试剂盒说明书进行HE染色，并在显微镜下观察甲状腺组织变化。
1.2.5TUNEL染色观察甲状腺细胞凋亡情况
石蜡切片经脱蜡、脱水、封闭后添加TUNEL工作液室温下孵育1 h，加入抗荧光猝灭剂进行封片，在共聚焦显微镜下观察切片中细胞凋亡情况，采用Image-pro plus定量细胞凋亡率，细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.2.6Western blot法检测甲状腺组织PI3K、p-Akt、caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平
取-80 ℃保存的甲状腺组织，于4 ℃冰箱中解冻后，用组织匀浆器匀浆，离心分离后，取上清液，蛋白提取试剂盒提取蛋白，蛋白定量BCA试剂盒检测蛋白总浓度后，取50 μg蛋白上样，进行电泳和转膜反应。TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗(PI3K、p-Akt、caspase-3、Bcl-2、β-actin)，稀释倍数分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000)，4 ℃摇床室温孵育过夜，TBST溶液清洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀释倍数1∶2 000)，37 ℃摇床室温孵育1 h，TBST溶液清洗3次后，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达水平。
1.3 统计学处理
2 结 果
2.1 各组大鼠一般行为、体重、甲状腺重量
Normal组大鼠行为活动正常，毛色光泽柔顺；与Normal组相比，SD组大鼠出现精神萎靡、身体消瘦、皮毛无光泽，抓取时出现尖叫、狂躁行为，且体重和甲状腺重量减轻(P<0.05)；与SD组大鼠相比，丙泊酚低、中、高剂量组精神萎靡、身体消瘦、皮毛无光泽，抓取时出现尖叫、狂躁行为减少，且体重和甲状腺重量升高(P<0.05)，且丙泊酚各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见表1。
表1 各组大鼠体重和甲状腺重量比较
2.2 各组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平
与Normal组相比，SD组大鼠血清FT3、TSH水平升高(P<0.05)，FT4水平降低(P<0.05)；与SD组相比，丙泊酚低、中、高剂量组血清FT3、TSH水平降低(P<0.05)，FT4水平升高(P<0.05)，且丙泊酚各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见表2。
2.3 各组大鼠甲状腺组织HE染色
Normal组大鼠甲状腺形态正常，可见甲状腺滤泡呈圆形或椭圆形,滤泡上皮细胞为单层立方状，周围可见毛细血管，细胞核位于细胞中央，滤泡腔内充满中等量粉红色胶质。与Normal组相比，SD组大鼠出现滤泡腔减小，滤泡上皮细胞呈扁平状且排列紊乱，滤泡高度增生，形成无腔细胞团等病理损伤。与SD组相比，丙泊酚各剂量组上述病理损伤程度逐渐减少，见图1。
2.4 各组大鼠甲状腺组织TUNEL染色
Normal组大鼠甲状腺细胞染色正常。与Normal组相比，SD组大鼠细胞形状不规则，大小不一，细胞核固缩且染色较深，棕黄色或棕色颗粒增多，且细胞凋亡率增高(P<0.05)。与SD组相比，丙泊酚各剂量组细胞核染色较浅，棕黄色或棕色颗粒明显减少，且细胞凋亡率呈剂量依赖性降低(P<0.05)，见图2。
2.5 各组大鼠甲状腺组织PI3K、p-Akt、caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平
与Normal组相比，SD组大鼠甲状腺组织PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)，caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)；与SD组相比，丙泊酚低、中、高剂量组大鼠甲状腺组织PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)，caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05)，且丙泊酚各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见图3、表3。
表2 各组大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比较
A:Normal组；B:SD组；C:丙泊酚低剂量组；D:丙泊酚中剂量组；E:丙泊酚高剂量组。
A:Normal组；B:SD组；C:丙泊酚低剂量组；D:丙泊酚中剂量组；E:丙泊酚高剂量组。
表3 各组大鼠甲状腺组织PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平比较
A：Normal组；B：SD组；C：丙泊酚低剂量组；D：丙泊酚中剂量组；E：丙泊酚高剂量组。
3 讨 论
SD会影响患者的摄食、饮水、排泄及新陈代谢等生理活动，进而影响患者体重和脏器指数。研究证实SD模型大鼠可出现体重减轻，脾脏、肺和心脏的脏器系数降低[11]及狂躁、易“激惹”、尖叫行为[12]。本研究发现,SD组大鼠体重及甲状腺重量明显低于Normal组，且大鼠出现皮毛颜色变暗、狂躁、尖叫行为，表明造模成功。TSH可控制甲状腺细胞大小及数目、甲状腺激素合成，并调节甲状腺功能，而FT3、FT4能够精确反映机体激素水平[13]。睡眠不足患者存在下丘脑-垂体-甲状腺轴的功能亢进状态[14]，而抑制甲状腺功能亢进状态，可改善睡眠[15]。本研究每日对大鼠进行SD 22 h，连续21 d后，SD组大鼠血清FT3、TSH水平升高，FT4水平降低，推测可能随着SD时间延长，机体调节能力难以代偿，造成严重的内分泌器官损伤，导致促甲状腺激素受体分泌不足，TSH代偿性升高，造成甲状腺机能异常，FT4向FT3转化增多，激素分泌紊乱。另外本研究发现SD大鼠分泌器官甲状腺出现滤泡腔减小、排列紊乱等病理损伤，且甲状腺细胞凋亡率明显高于Normal组，进一步证实SD延长会使甲状腺分泌功能受损及激素分泌紊乱现象，这一发现与文献[9]一致。
丙泊酚是一种全身静脉麻醉药，被广泛应用于多种短小手术的麻醉和镇静。近年研究证实，丙泊酚可改善SD患者睡眠[8]。肖军等[16]发现丙泊酚联合刺五加注射液可改善SD大鼠睡眠状况。本研究给予SD大鼠丙泊酚后，丙泊酚低、中、高剂量组大鼠体重、甲状腺重量、FT4水平明显高于SD组，FT3、TSH水平、甲状腺细胞凋亡率均低于SD组且接近正常水平，大鼠毛色发暗、狂躁、尖叫行为及甲状腺组织滤泡腔减小、排列紊乱等病理损伤明显缓解，推测丙泊酚可能促进大鼠睡眠，改善了因睡眠不足引起的甲状腺功能损伤及激素分泌紊乱现象，表明丙泊酚可改善SD大鼠睡眠不足引起的甲状腺组织损伤。然而其具体分子生物学机制还不甚明确。
PI3K/Akt信号通路为细胞内重要信号转导通路之一，可通过调节凋亡信号蛋白从而影响细胞的分化及存活[17]。研究证实甲状腺炎患者炎症因子IL-23升高，可抑制PI3K/Akt活化，促进Akt下游促凋亡蛋白caspase-3表达，减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达，而促进甲状腺上皮细胞凋亡，提示炎症刺激可通过抑制PI3K/Akt通路激活，诱导甲状腺上皮细胞凋亡，促进甲状腺疾病的发生、发展[18]。机体受到SD刺激后，下丘脑-垂体-甲状腺轴被激活，可使TSH释放增多[19]，而TSH可与TSHR结合并通过激活腺苷酸环化酶上调PI3K/Akt信号传导途径，发挥抗凋亡和细胞增殖作用[20]。本研究发现，SD组大鼠甲状腺组织中PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平低于Normal组，caspase-3蛋白表达水平高于Normal组，提示SD大鼠甲状腺组织中PI3K/Akt通路抑制，凋亡蛋白增加，然而这与TSH升高，促进PI3K/Akt通路激活发挥抗凋亡作用相违背，推测可能由于随着SD时间延长，机体细胞调节能力难以代偿，TSH过度在甲状腺滤泡内积聚，使内分泌器官损伤严重，而TSH代偿性升高可能仍不足以促进PI3K/Akt通路激活发挥抗凋亡作用，这就解释了TSH分泌过多与甲状腺功能异常及甲状腺疾病的关系[21]。而丙泊酚低、中、高剂量组大鼠甲状腺组织PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平高于SD组，caspase-3蛋白表达水平低于SD组，且趋向于正常，表明丙泊酚可促进PI3K/Akt通路激活，提示丙泊酚抑制SD大鼠甲状腺细胞凋亡，改善甲状腺激素分泌功能的作用，可能与激活PI3K/Akt通路有关。
综上所述，丙泊酚可激活SD大鼠甲状腺组织PI3K/Akt通路蛋白表达，抑制甲状腺细胞凋亡和损伤，改善机体激素分泌，这可能为阐明丙泊酚改善SD睡眠和缓解睡眠不足引起的甲状腺功能损伤，提供一定参考，但睡眠不足引起甲状腺损伤机制复杂，本研究未设置通路抑制剂进行验证，睡眠不足引起的机体功能异常的具体生物学机制仍需继续研究。
