非新鲜腹泻粪便样本艰难梭菌检测方法的研究*

王 浦，陈 烨

(南方医科大学南方医院消化内科/广东省南方消化疾病研究所，广州 510515)

临床上大剂量、多疗程使用广谱抗生素，以及激素、免疫制剂等滥用[1],破坏正常肠道菌群平衡,艰难梭菌(CD)趁势迅速生长，产生毒素破坏肠黏膜屏障，引起艰难梭菌感染(CDI)及伪膜性肠炎，导致细菌易位，脓毒血症，甚至多器官功能衰竭，给临床带来了极大的压力与医疗支出[2-4]。

CD检测方法有多种，但因培养条件及技术要求高、耗时长，不能用于临床常规检测[5]。目前，国内外临床广泛采用酶免疫学试验(EIA)，针对艰难梭菌A或B毒素进行检测，可在2 h内快速完成测定。但该方法存在交叉反应、假阳性率高、特异度差[6- 7]。临床诊疗过程中，常常发现假阴性的例子，从而延误患者的治疗。利用分子生物学PCR 技术可检测CD毒素基因，但不适合应用于基层医院及现场快速检测。因此，寻找新型的稳定性好、特异度高并且方便快捷的检测手段一直是研究热点[8-13]。GeneXpert C.difficile荧光定量PCR检测系统(Cepheid,GX-XVI)可以特异性的检测艰难梭菌tcdB基因，整合了传统PCR检测所需的3个步骤(样品制备、扩增和检测)，全程自动化，方便快捷。研究表明，该技术检测新鲜粪便标本CD，灵敏度好、特异度高，是一种应用前景很广泛的CD检测技术[13-16]。

CD常规要求粪便标本取样后30 min内检测，因此局限了检测区域，不利于大范围开展检测及常规筛查。此外，有些医疗机构不具备CD检测设备及技术，标本需冻存后寄往相关单位进行检测，也可能影响检测结果[6]。本研究的目的是寻找一种快速有效的非新鲜腹泻粪便标本CD检测技术，通过比较GX-XVI及EIA对冻存标本检测的优劣，提高冻存标本的检测水平，以期快速、便捷、准确的用于临床检测、筛查、鉴定及预防CDI，扩大CD检测覆盖范围，对于基层医疗机构合理选择用药、提高疗效、减缓细菌耐药及控制院内感染[17]，减轻医疗压力，具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

标本来源于2014年2月到2019年2月南方医科大学南方医院住院患者共200份新鲜腹泻粪便标本(排出后立即取样，厌氧运送，0.5 h内接种或保存)。入选标准：年龄≥18岁的住院患者；60 d内接受过抗生素治疗或化疗等药物治疗，住院后48 h后出现腹泻，且24 h内腹泻次数≥3次，不成形大便(布里斯托分类5～7级)。排除标准：各种类型的感染性腹泻，如细菌性痢疾、伤寒、食物中毒、原发性腹膜炎和阿米巴痢疾等；肠道功能性疾病，如肠易激综合征等；其他有除抗生素以外明确原因的腹泻，如乳糖不耐受等。剔除标准：因仪器或人为因素导致无法完成整个试验过程的样本；病例资料不全的样本。本研究经本院伦理委员会审核并通过(NFEC-2014-078)。

1.2 主要试剂及仪器

CD标准菌株 (VPI10463)来自兰州微生物研究所馈赠。难辨梭菌琼脂基础，难辨梭菌培养基选择添加剂，Eugon肉汤等CD液体、固体培养基及添加剂，购自BD及OXOID公司。厌氧指示剂，API20A 快速生化鉴定试剂盒及革兰染色液套装，艰难梭菌毒素A/B 检测试剂盒购自生物梅里埃公司。保存液：甘油与Eugon肉汤按3/7比例混合。

1.3 方法

1.3.1粪便标本处理

取新鲜腹泻粪便标本，按标准操作流程(SOP)，行CD分离培养及生化鉴定，PCR鉴定毒素。剩余粪便标本加冻存液(1∶1)-80 ℃低温冰箱保存1年以上。检测时，快速解冻，4 ℃静置24 h，然后分别采用细胞毒性实验(CCTA)、GX-XVI和EIA检测CD。

1.3.2新鲜粪便标本CD分离培养及生化鉴定

2 mL Eugon肉汤加入约0.2 mL新鲜粪便样本，混匀；把大便悬浮液放在水浴锅上80 ℃加热10 min，然后降温到室温，放置5 min，取1滴加入艰难梭菌选择液体培养基(CCMB-TAL)液体培养管中，35 ℃厌氧培养。培养5 d后观察颜色变化,如CCMB-TAL培养基变色，表明可能有CD存在。另外吸取50 μL悬浮液加于新鲜配制的艰难梭菌选择琼脂(CCFA-HT)平板中，37 ℃厌氧培养72 h。如观察到粗糙、边缘不整齐疑似菌落，则纯分后接种至普通血平板，37 ℃厌氧培养48 h。如耐氧试验无须氧菌生长，则革兰染色涂片，油镜下如看到较粗的革兰染色阳性，部分次极端有芽孢者怀疑为CD。取此单个菌落接种至血平板，以API20A行生化鉴定。经生化鉴定后确定CD标本，进一步采用PCR技术检测CD毒素。

1.3.3CCTA检测非新鲜粪便标本CD

解冻及静置24 h后粪便标本，按上述流程CMB-TAL培养5 d。取上述CMB-TAL培养基上清液，PBS稀释，20 mL的上清液转移到成纤维细胞，37 ℃，96孔板，5%二氧化碳环境，含有热灭活10%胎牛血清的Eugon肉汤培养基培养24 h，观察细胞毒效应。标准株VPI10463作为阳性对照。

1.3.4GX-XVI检测非新鲜粪便标本CD

操作方法严格按照操作说明书进行。

1.3.5EIA检测非新鲜粪便标本CD

使用艰难梭菌毒素A/B检测试剂盒检测CD毒素，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.6结果分析

比较新鲜及非新鲜粪便标本CD检出阳性率，评估冻存及解冻后静置对检出率的影响。比较GX-XVI、EIA对非新鲜标本CD的检测，评价其检测效能。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计学处理。分类计数资料采用χ2检验，GX-XVI、EIA与CCTA的一致性采用McNemar及Kappa系数分析。GX-XVI及EIA的敏感度、特异度、约登指数(Youden)，阳性似然比及阴性似然比采用MedCalc13进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 新鲜粪便标本CD鉴定及菌株分离

200份新鲜腹泻粪便标本经标准SOP富集培养，PCR毒素鉴定，最终得到70例产毒CD菌株，见图1。

A：伪膜性肠炎结肠镜图片，内镜下可见乙状结肠散在淡黄色伪膜，黏膜充血易脆；B：伪膜性肠炎病理图片(100×)，黏膜固有层中性粒细胞浸润，上皮细胞破损，黏膜表面有分泌物；C：CD临床分离菌株，革兰阳性杆菌(Gram，1 000×)；D：艰难梭菌 A/B 毒素基因(tcdA/tcdB)PCR 扩增后琼脂糖凝胶电泳结果；M：分子量标准1 000 bp；tcdA：546 bp；tcdB：204 bp。

2.2 非新鲜粪便标本CD阳性率比较

非新鲜粪便标本分别采用CCTA、GX-XVI和EIA检测CD。CCTA提示CD毒素阳性标本数为68份，与新鲜粪便标本培养鉴定结果无差异(P=0.833，95%CI：0.692～1.579)。解冻后3种检测方法阳性率差异有统计学意义(χ2=6.799，P=0.033)，见表1。

表1 解冻后3种检测方法阳性率比较

2.3 非新鲜粪便标本GX-XVI与CCTA检测结果比较

非新鲜粪便标本经GX-XVI检测确定65例毒素阳性标本。62例(31.0%)标本为真阳性，129例(64.5%)为真阴性。与CCTA相比，经配对计量资料McNemar检验，两种诊断结果无明显差异(P=0.508)，吻合系数Kappa=0.899，见表2。

表2 非新鲜样本GX-XVI与CCTA阳性情况比较(n)

2.4 非新鲜粪便标本EIA与CCTA检测结果比较

非新鲜粪便标本经毒素EIA测定，阳性标本56例。52例(26.0%)标本为真阳性，128例(64.0%)为真阴性。与CCTA相比，经配对计量资料McNemar检验，两种诊断结果有明显差异(P=0.001)，吻合系数Kappa=0.516，见表3。

表3 非新鲜样本EIA与CCTA阳性情况比较(n)

2.5 一致性分析

采用医学统计学软件MedCalc13进行分析，结果表明，对于非新鲜粪便标本，与CCTA相比，GX-XVI检测的灵敏度 91.18%(95%CI：81.8%～96.7%)，特异度97.73%(95%CI：93.5%～99.5%)，约登指数73.5%，阳性似然比40.12(95%CI：13.1～123.1)，阴性似然比0.090(95%CI：0.04～0.20)。相应地，EIA检测非新鲜粪便标本CD灵敏度76.5%，特异度97.0%，约登指数73.5%。阳性似然比25.5，阴性似然比为0.242。

3 讨 论

分析临床CD检测阳性率低的原因，可能和标本未能及时送检，以及临床EIA检测技术敏感性不足有关，因此，设计本研究寻找能提高临床CDI诊断阳性率及准确率的方法。采用冻存1年以上的腹泻粪便标本(冻存前已行细菌学培养及鉴定)，复苏后4 ℃静置24 h，然后CCTA检测CD，结果表明长时间冻存及低温静置对CD检出率无明显影响。

分别采用GX-XVI及EIA对复苏及静置后粪便标本进行检测,结果发现，与CCTA相比，GX-XVI检测CD灵敏度为91.18%，漏诊少，特异度97.73%，说明GX-XVI确定非患者的能力好，误诊少。Kappa值为0.899，基本达到与CCTA检测结果相一致的水平。约登指数88.90%，说明仪器诊断真实程度高，筛查能力强。阳性似然比为40.12，远大于10.00，说明GX-XVI能正确诊断非新鲜粪便样本CD可能性大。GX-XVI阴性似然比为0.09，远小于1，错误判断阴性的可能性小。EIA检测非新鲜标本，特异度高，但灵敏度较差，容易出现假阴性，与CCTA结果一致性差。EIA特异度较高的原因，可能与标本长期冻存，以及静置后杂菌死亡相关(CD在极端条件下形成芽孢，生存能力较强)，交叉反应概率变小。

因此，对于收集后不能立即送检的粪便标本，采用GX-XVI荧光定量PCR进行检测，灵敏度好，特异度高，与CCTA检测结果一致性好。且GX-XVI可同时检测二元毒素基因及tcdC基因nt117位点缺失，对于监测B1/NAP1/027暴发流行极为有意义。GX-XVI从准备样品到出结果，全程自动，对工作环境和操作人员无特殊要求，1 h内就能检测出结果，可以做到及时隔离治疗CDI患者。同时避免了传统培养分离鉴定及EIA检测过程中研究人员与传染性病原体长期接触，有效保护了医务人员及科研人员身体健康，减少暴发流行危险[13,18]。最后，GX-XVI大约需要50 min即可得出结果，方便快捷，适合大范围的检测。

综上所述，GX-XVI可以用于大范围的CDI诊断，有望用于临床 CDI的筛查。对于预防CDI，指导临床合理选择用药，提高基层医疗机构CDI诊疗效率，减缓细菌耐药，控制院内感染播散，减轻医疗压力具有重要意义，可作为临床CDI常规筛查仪器。如果没有该设备，或者缺乏荧光定量PCR技术条件，可考虑采用普通PCR结合EIA检测非新鲜粪便标本，弥补普通PCR特异度不足的问题。