水通道蛋白9在PCOS大鼠卵巢组织的表达*

潘海霞，冼佩宜，张春仁，林 菡，何晓莹，唐慧珍，赖毛华△

(1.广州医科大学附属第一医院中西医结合临床妇科，广州 510120；2.广州中医药大学第三附属医院中医妇科，广州 510120)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种常见的妇科内分泌代谢紊乱性疾病，据报道，育龄妇女中PCOS的患病率为6%～10%[1]，具有高度异质性、发病多因性、表现多态性的特点。临床主要表现为闭经、多毛、肥胖、高胰岛素血症、高雄激素血症、不孕，超声显示多囊卵巢等[1]。文献报道，75%的PCOS患者表现为无排卵性不孕[2]，卵泡发育障碍是导致PCOS不孕的主要原因。因此，探究PCOS卵泡发育障碍的机制对提高PCOS患者的生育力具有重要意义。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组存在于细胞膜上的小分子蛋白家族，可使细胞膜对水的通透性增加，对维持细胞内外的水平衡意义重大。目前在哺乳动物中鉴定出13种AQPs(AQP0～12)亚型。AQP0、1、2、4、5、6和8对水的通过具有高度的选择性，而AQP3、7、9和10不仅运输水，还运输中性溶质，包括甘油、尿素和其他小的非电解质[3]。WAWRZKIEWICZ等[4]认为AQPs可能参与了PCOS的发生，其表达的变化可能影响PCOS的卵泡发育和卵泡闭锁。QU等[5]发现PCOS患者颗粒细胞的细胞核、细胞质和细胞膜中存在 AQP9，PCOS组的AQP9表达水平明显低于正常组，AQP9与卵泡液的雄激素水平有明显的相关性。SONG等[6]发现PCOS患者颗粒细胞AQP9基因和蛋白表达水平较低，AQP9的表达水平与胰岛素调节呈负相关，胰岛素可能通过改变AQP9的表达影响PCOS卵泡的成熟。因此，推测AQP9可能参与了PCOS的卵泡发育障碍的发生，但确切的机制尚不清楚。

本研究主要通过来曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型，采用免疫组织化学和Western blot观察AQP9在卵巢组织中的定位及蛋白的表达，为进一步探讨AQP9与PCOS卵泡发育的关系提供理想的动物模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雌性大鼠12只，6周龄，超级清洁(SPF)级，体重(155±10)g，购自广东省动物实验动物中心。自由摄取食物和水，温度20～22 ℃，湿度60%～65%，控制12 h光照、12 h黑暗环境循环，喂食标准饲料。本研究获得广州医科大学动物科学学院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1PCOS模型的建立

12只SD雌性大鼠，分为正常组与模型组，每组6只。模型组参考文献[7]的造模方法，每天予来曲唑(1 mg/kg)溶于0.5%羧甲基纤维素(CMC，2 mL/kg)灌胃，构建PCOS模型；正常组每天灌胃0.5% CMC(2 mL/kg)，连续21 d。

1.2.2标本处理

最后1次灌胃后，称重，两组大鼠晚8时开始禁食，次日晨8时尾静脉采血，用葡萄糖氧化酶法测空腹血糖(罗氏血糖仪)，然后异氟烷气体麻醉后进行心脏采血，3 000 r/min离心15 min，-80 ℃冻存用于进一步测试，最后断颈处死大鼠，摘取双侧卵巢，去除表面脂肪组织观察两组大鼠卵巢大体解剖情况，称重并记录后，一侧浸泡在4%的多聚甲醛中进行固定以便后续的组织病理分析，一侧卵巢放在冻存管中，以便后续的蛋白和基因的检测分析。

1.2.3观察指标

1.2.3.1大鼠体重、阴道涂片及卵巢质量

每天灌胃之前对大鼠进行称重，且记录数据。灌胃第10天开始对模型组大鼠进行阴道涂片，阴道涂片两个动情周期(10 d)，使用瑞氏-吉萨姆进行染色，通过分析白细胞、上皮细胞和角化细胞的相对比例来监测动情周期。吸入麻醉处死大鼠后，称重双侧卵巢，左、右卵巢的质量计算卵巢质量。

1.2.3.2性激素及糖代谢检测

使用ELISA法进行血清中黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、雄激素、雌二醇和空腹胰岛素测定，罗氏血糖仪测空腹血糖。计算LH/FSH和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR=(空腹胰岛素×空腹血糖)×22.5。

1.2.3.3卵巢组织学改变

在解剖镜下剥除卵巢外周脂肪，观察卵巢大体解剖情况。卵巢用4%多聚甲醛固定，进行常规石蜡包埋、切片及苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察其形态学改变。

1.2.3.4免疫组织化学检测

按照试剂说明书，石蜡包埋，蜡块做5 μm的切片，将玻片置于60 ℃恒温箱烤30 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。3%过氧化氢溶液10 min灭活内源性过氧化物酶。微波修复抗原。滴加5%牛血清，38 ℃下孵育10 min，倾去勿洗。滴加一抗兔抗大鼠AQP9(美国Santa Cruz公司)，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min，3次。滴加对应生物素标记的二抗，37 ℃下孵育30 min，PBS冲洗。滴加SABC，37 ℃下孵育20 min，PBS冲洗。DAB显色：除去PBS，每张切片加新鲜配制的DAB溶液显色，自来水冲洗。梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.3.5Western blot

按照试剂说明书，将100 mg的卵巢组织放入0.6 mL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1,v/v)中裂解，用冰冻露卡匀浆机强力粉碎。匀浆于4 ℃、1 200 r/min离心20 min。转移并收集上清液用于蛋白分析。每个样品的蛋白浓度采用BCA蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。随后，将提取的样品煮沸10 min，-80 ℃保存待分析。负载蛋白(50 g)电泳，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.22 m,美国Pall公司)。PVDF膜在5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，然后用不同的一抗孵育4夜，包括抗AQP9 (美国Santa Cruz公司)和抗β-actin(美国Abcam公司)。一抗一般用TBST (Tris-HCl 5 mmol/L,pH 7.6,NaCl 136 mmol/L,0.05% Tween-20) 1∶1 000稀释。洗后TBST 3次，再与辣根过氧化物(HRP)结合二抗(1∶5 000稀释TBST)孵育2 h，与一抗结合。Western blot采用增强化学发光法(ECL)。图像采用Bio-Rad进行采集，Image-J软件进行密度测定分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组体重、卵巢质量和阴道涂片比较

与正常组比较，模型组体重和卵巢质量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。正常组具有规律的动情周期，模型组则几乎处于以白细胞为主的动情间期，见图3。

a：P<0.05。

a：P<0.05。

A：正常组动情期；B：正常组动情前期；C：正常组动情间期；D：正常组动情后期；E：模型组动情间期。

2.2 两组血清性激素及糖代谢指标比较

与正常组比较，模型组LH、LH/FSH、雄激素、空腹胰岛素和HOMA-IR水平升高，FSH和雌二醇水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组血清性激素及糖代谢指标比较

2.3 卵巢组织学改变

正常组卵巢色泽红，表面光滑，卵巢结构清晰，可见不同发育阶段的卵泡，多个黄体，颗粒细胞呈多层，形态完整，排列整齐。模型组卵巢形态苍白，可见较多的早期发育小卵泡及闭锁卵泡，有较多扩张的囊泡，卵泡内卵母细胞消失，卵巢颗粒细胞层数减少，卵泡膜细胞增生，黄体数量明显下降，见图4。

A：正常组，×20；B：正常组，×200；C：模型组，×20；D：模型组，×200。

2.4 两组卵巢AQP9蛋白免疫组织化学染色情况

两组卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞、黄体细胞及间质细胞均可见AQP9蛋白表达，但以颗粒细胞较明显，主要位于细胞膜和细胞质中，呈棕黄色，模型组大鼠卵巢颗粒细胞 AQP9蛋白的表达较正常组降低，见图5。

A：正常组，×50；B：正常组，×400；C：模型组，×50；D：模型组，×400。

2.5 两组卵巢 AQP9 蛋白表达情况

模型组AQP9蛋白表达水平较正常组减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

a：P<0.05。

3 讨 论

来曲唑是一种高选择性非甾体类芳香化酶抑制剂，通过抑制它的底物芳香化酶阻断雄激素向雌激素的转换，降低雌二醇浓度，升高雄激素，导致无排卵[8]。本研究PCOS大鼠模型组特征与前期研究利用来曲唑灌胃法成功构建 PCOS 大鼠模型报道相似[7,9]。因此，本实验采用来曲唑诱导的大鼠模型无论是内分泌、代谢紊乱方面，还是从卵巢解剖及组织学方面均与人类PCOS特征相似，是研究PCOS机制的理想动物模型。

卵泡发育历经原始卵泡、窦前卵泡、窦卵泡，最终成为成熟卵泡这一系列过程中，卵泡液的形成及卵泡窦腔的扩大有着极其重要的地位[10]。窦卵泡主要是通过颗粒细胞上的水通道实现水的转运，在卵泡发育过程中形成卵泡液，最终成为成熟卵泡[11]。在卵泡发育过程中，AQP9主要表达于窦状卵泡的颗粒细胞中[11]，其参与了颗粒细胞的水转运，可能与卵泡发育有关[12]。SALES等[13]研究认为 AQP9在卵泡的发育中起着重要的作用。RIBEIRO等[12]对小鼠进行超促排探究卵泡发育，过程中发现AQP9在卵泡快速发育阶段表达明显增加，且对AQP9进行抑制发现卵泡体积明显变小、排卵数减少，推测AQP9在卵泡腔迅速形成过程中促进了水和其他物质的大量纳入，为卵泡的进一步发育和成熟提供了环境和物质基础。

在PCOS患者卵巢内存在大量的窦前卵泡、少数窦状卵泡、众多的闭锁卵泡、滤泡囊肿和变性的囊肿。这些卵泡缺乏足够多的成熟颗粒细胞，不能产生大量的雌激素，最终导致排卵障碍。另一方面，卵巢间质和卵泡膜组织增生持续产生雄激素[14-15]。有研究报道，PCOS患者卵巢组织AQP9 mRNA表达明显降低[2]。AQP9的表达可能是受雄激素调控[16]。一项临床研究发现PCOS患者颗粒细胞中AQP9表达水平降低，这一改变可能与卵泡液中高雄激素有关，雄激素可降低颗粒细胞中AQP9基因和蛋白表达[5]。另一项研究也支持这个观点，通过在母猪的卵巢进行免疫组织化学定位发现，AQP9主要在正发育的颗粒细胞中表达，研究结果提示颗粒细胞中雄激素转换为雌激素可能需要通过AQP9转运的物质来实现[17]。此外，SONG等[6]发现AQP9广泛分布在PCOS卵巢组织，PCOS壁层颗粒细胞和卵丘颗粒细胞中均有AQP9基因及蛋白质，PCOS患者卵巢颗粒细胞AQP9的表达水平明显下降。胰岛素可能通过改变AQP9基因的表达，PCOS 卵巢局部高雄激素和高胰岛素可使颗粒细胞增殖能力下降，从而导致其卵巢内形成较多的初级卵泡，引起卵泡发育障碍[18-19]。推测过高的胰岛素水平和雄激素可能会损害颗粒细胞的增殖功能，导致AQP9的低表达，从而引起卵泡发育障碍，这为探讨PCOS患者的发病机制提供了一个潜在的新思路和治疗的新靶点。本研究表明PCOS大鼠模型卵巢AQP9主要表达在卵巢颗粒细胞，定位在细胞膜和细胞质，AQP9蛋白表达水平较正常组降低，这些特征符合PCOS患者在卵巢的表达特征。

综上所述，来曲唑诱导的 PCOS 大鼠模型是符合 PCOS 病理生理机制的理想动物模型。本实验通过免疫组织化学和Western blot测定了PCOS大鼠卵巢AQP9的定位和蛋白的表达特点，但AQP9影响PCOS卵泡发育及卵母细胞成熟的机制仍需进一步研究。