谢 容，陈 建，陈 键，洪秀琴，2△
(1.湖南师范大学附属第一医院/湖南省人民医院科研部，长沙 410005；2.湖南省分子流行病学重点实验室，长沙 410013；3.湖南省湘潭市疾病预防控制中心 411199)
原发性高血压伴血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)升高(Hcy>10 μmol/L)称为H型高血压[1]，约占总高血压人群的80%[2]，H型高血压患者罹患心脑血管疾病的风险较单纯原发性高血压增加。研究表明，H型高血压患者脑卒中发生率为单纯原发性高血压患者的12.7倍[3]，心肌梗死发生率为单纯原发性高血压患者的5倍[4]。女性进入绝经期，体内雌激素水平持续下降，影响内皮功能的正常调节，内皮依赖性血管舒张降低，引起血压明显波动[5]。绝经期高血压患者伴发高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)使病情控制难度增大，同时还增加心血管疾病发生风险。目前的动物研究以H型高血压大鼠模型和雌激素匮乏型高血压模型为主，鲜有对绝经期H型高血压模型的探索。因此，本研究通过将H型高血压大鼠模型和雌激素匮乏模型整合，探索绝经期H型高血压动物模型的建立方法，并探讨其可行性，从而为更好地研究这一特殊群体的病理生理特点提供支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
雌性无特殊病原体(SPF)级自发性高血压(SHR)大鼠27只(北京维通利华公司)，6～8周龄，体重160～180 g。动物合格证号：SCXK(京)2016-0006。
1.1.2药品与试剂
DL-蛋氨酸粉末(张家港市华昌药业有限公司)；2%蛋氨酸饮水(2 g DL-蛋氨酸粉末加入双蒸水定容至100 mL制备)。
1.1.3实验仪器
BP-300A全自动大鼠无创血压监测仪(成都泰盟软件有限公司)；日立7600生化分析仪(日本HITACHI公司)，安图A2000化学发光仪(郑州安图生物工程股份有限公司)，湘仪H1650R离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。
1.2 方法
1.2.1实验动物分组
SHR大鼠适应性喂养1周，分为con组、2%met组和ovx+2%met组，各9只。con组为正常对照组，进行假手术，普通饮水；2%met组为H型高血压模型组，进行假手术，饮用2%蛋氨酸水；ovx+2%met组为绝经期H型高血压模型组，进行双侧卵巢切除术，给予2%蛋氨酸水。
1.2.2实验动物模型的制备
适应性喂养1周后，各组大鼠在无菌条件下进行腹腔麻醉注射。动物备皮后，ovx+2%met组采用背部双切口进行大鼠双侧卵巢切除，假手术组(con组和2%met组)则在粉色卵巢组织周边切除同等大小的脂肪。术后采用红霉素抗感染处理。伤口愈合后，2%met组和ovx+2%met组用2%蛋氨酸水喂养，con组喂养普通饮用水。
1.2.3饮水量的记录
以7 d为1个周期，每个周期第1天在大鼠饮水瓶加入250 mL水，1周后测量剩余饮水量，获得大鼠的周饮水量，连续收集12周。
1.2.4大鼠收缩压(SBP)的测量
利用BP-300A全自动大鼠无创血压监测仪收集喂养后第2、4、6、8、10、12周的SBP。测量血压前预热无创血压检测仪，进行系统漏气检测。根据大鼠体重采用不同固定器固定。待大鼠平稳安静后，将鼠尾插入加压套至尾巴根部，将鼠尾脉搏传感器置于鼠尾上1/3尾动脉处。
1.2.5血生化指标检测
通过眼眶采血的方式收集大鼠血液标本后送至湖南省人民医院马王堆院区检验科进行血生化指标的检测。利用安图安图A2000化学发光仪在喂养后第2周检测雌二醇(E2)水平；利用日立7600生化分析仪在喂养第6、10、12周检测Hcy水平，在喂养第12周检测血浆葡萄糖(BS)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)水平。
1.3 统计学处理
2 结 果
2.1 各组大鼠周饮水量比较
3组平均周饮水量比较，差异有统计学意义(F=173.46，P<0.01)，且2%met组与ovx+2%met组周饮水量均明显小于con组(P<0.01)，而2%met组与ovx+2%met组周饮水量无明显差异(P>0.05)，见图1。
2.2 各组大鼠血清Hcy水平比较
不同喂养时间各组间大鼠血清Hcy水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；喂养第6周，ovx+2%met组大鼠血清Hcy水平明显高于con组和2%met组(P<0.01)，con组与2%met组无明显差异(P>0.05)；喂养第10周，ovx+2%met组和2%met组大鼠血清Hcy水平均明显高于con组(P<0.01)，且ovx+2%met组与2%met组大鼠血清Hcy水平也有明显差异(P<0.01)；喂养第12周，2%met组和ovx+2%met组大鼠血清Hcy水平均超过10 μmol/L，ovx+2%met组大鼠血清Hcy水平明显高于2%met组(P<0.05)，且两组血清Hcy水平均明显高于con组(P<0.01)，见表1。
2.3 各组大鼠血清E2水平比较
喂养第2周，3组大鼠血清E2水平比较，差异有统计学意义(F=29.990，P<0.01)；ovx+2%met组大鼠血清E2水平明显低于con组和2%met组(P<0.01)，且con组和2%met组大鼠血清E2水平无明显差异(P>0.05)，见图2。
图1 大鼠周饮水量曲线图
表1 各组大鼠不同喂养时间血清Hcy水平比较
a：P<0.01，与con组相比；b：P<0.01，与2%met组相比。
2.4 各组大鼠不同喂养时间SBP比较
喂养第8、10、12周，3组大鼠血清SBP水平比较，差异均有统计学意义(F=5.183，P<0.05；F=6.259，P<0.01；F=173.500，P<0.01)；ovx+2%met组与2%met组大鼠SBP在各时间点均高于con组，且从第8周开始，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)，ovx+2%met组与2%met组大鼠SBP在各时间点均无明显差异(P>0.05)，见图3。
a：P<0.01，b：P<0.05，与con组相比。
2.5 各组大鼠生化指标水平比较
喂养第12周，3组大鼠血浆TC、HLD水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；2%met组和ovx+2%met组大鼠血浆TC、HDL水平均明显高于con组(P<0.01)，且ovx+2%met组大鼠血浆TC、HDL水平均明显高于2%met组(P<0.01或0.05)，见表2。
表2 各组大鼠生化指标水平比较
3 讨 论
两侧卵巢手术切除所致绝经称为人工绝经，术后雌激素水平降低，可出现血管舒缩障碍。双侧卵巢切除术由于具有控制因素单一、手术成功率高和造模结果稳定等优点，目前已被广泛应用于模拟绝经导致的雌激素水平匮乏[6-7]。预实验与赵梓妍等[8]研究显示，与经腹部的双侧卵巢切除术相比，经背部双侧卵巢切除术所造成的伤口小，轻微剥开切口处脂肪即可看到粉色输卵管和卵巢组织，避免了探查过程造成的临近脏器损害或肠扭转。所以，本实验采用雌性SHR大鼠经背部双侧卵巢切除术建立高血压绝经模型。研究结果表明，与con组和2%met组相比，ovx+2%met组大鼠血清E2水平明显降低。该现象可反映高血压女性人工绝经后的雌激素水平状态。
高蛋氨酸饮食可诱导HHcy的发生。Hcy是蛋氨酸的中间产物，当机体摄入过量的蛋氨酸时，会影响胱硫醚-β-合成酶的活性，使得胱硫醚合成受阻，Hcy代谢受阻[9]；同时，蛋氨酸过量使甜菜碱水平明显降低，蛋氨酸再生障碍，造成Hcy堆积[10]。在通过饮食增加蛋氨酸负荷来制造HHcy模型的研究中，蛋氨酸常见浓度为0.5%～5.0%，造模成功时间从2周至3个月不等。任晓丽等[11]研究表明，SD大鼠给予5%蛋氨酸饮食在第8周时Hcy水平达到(10.07±0.09)μmol/L，而给予1%蛋氨酸饮食Hcy水平则为(9.04±0.06)μmol/L；同时，该研究提示饮食中蛋氨酸浓度>3%可能导致生长毒性。SHR大鼠是公认的模拟人类原发性高血压发病机制最稳定、最具代表的实验动物模型[12]。而蛋氨酸饲料属于特殊饲料，难以获得，自行制备不易。因此，本实验采用SHR+2%蛋氨酸饮水构建H型高血压大鼠模型。喂养第12周，2%met组血清Hcy水平达到(13.07±0.65)μmol/L，ovx+2%met组血清Hcy水平达到(14.20±1.29)μmol/L。根据H型高血压的判定标准(Hcy>10 μmol/L)[1]，SHR大鼠经12周2%蛋氨酸饮水能建立稳定的H型高血压大鼠模型。
Hcy水平升高是高血压的危险因素之一。Hcy异常升高会引起内皮功能障碍，导致内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)生成减少,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、 内皮素(ET)生成增加。舒血管物质减少，缩管物质增加，血管舒张功能障碍，使血压升高[13]。雌激素参与维持血压调节。雌激素能激活血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)，促进内皮细胞释放NO并提高其生物利用度；降低AngⅡ水平，调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统，发挥稳定血压的作用[14-15]。有研究显示，卵巢切除加重HHcy大鼠ET表达，使eNOS生成明显降低，补充雌激素通过降低血浆Hcy水平并拮抗eNOS表达来减轻HHcy带来的血管内皮细胞损害[16]。曹艳丽等[17]研究报道，喂养1周后，给予2%蛋氨酸饮水的SHR大鼠SBP明显高于双蒸水喂养组(P<0.05)；张志敏等[18]研究表明，从第8周起2%蛋氨酸组与对照组的SBP比较，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究结果表明，2%蛋氨酸喂养的大鼠SBP在各时间点均高于cos组，且从第8周起，差异有统计学意义(P<0.01)，与上述文献报道结果相似。但是，本研究中大鼠的SBP差异是否因切除卵巢后雌激素水平改变所致尚未能体现。
综上所述，本实验通过12周的2%蛋氨酸饮水+SHR大鼠卵巢切除术成功构建了稳定的绝经期H型高血压实验大鼠模型。
