鼻咽癌中VEGF-C的表达及其与颈淋巴结转移的关系

吴艳霞 吴冬梅 邓小青

广东医学院附属医院病理科，广东湛江 524001

鼻咽癌是我国常见的恶性程度较高的肿瘤之一，由于该病早期临床症状不明显，往往被确诊时已至中晚期，因此治愈率低，患者的预后较差[1]。有研究显示，血管内皮生长因子C(VEGFC)是淋巴管、血管内皮细胞调节因子的一种，也是血管内皮生长因子/血小板源生长因子(VEGF/PDGF)家族的新成员，当VEGF-C与VEGFR-3 结合后，对淋巴管的生成会产生强大的作用，与肿瘤的淋巴结转移及扩散有着密切的关系[2]。该研究通过对该院2008年1月—2012年12月收治的46 例鼻咽癌患者与42 例鼻咽癌颈淋巴结转移患者组织进行VEGF-C 检测，探讨分析VEGF-C 表达与鼻咽癌颈淋巴结转移的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择该院收治的鼻咽癌患者46 例为研究对象，作为鼻咽癌组，其中男26 例，女20 例，年龄25~67 岁，平均年龄（53.1±11.8）岁，WHO 分类：未分化型非角化性癌22 例，分化型非角化性癌18 例，角化性鳞状细胞癌6 例；TNM 分期：I~Ⅱ期26 例，Ⅲ~Ⅳ期20 例；同期选择该院收治的鼻咽癌并发颈淋巴结转移患者42 例为颈淋巴结转移组，其中男性32 例，女10 例，年龄29~62 岁，平均年龄（37.8±20.0）岁，WHO 分类：未分化型非角化性癌20 例，分化型非角化性癌17 例，角化性鳞状细胞癌6 例；TNM 分期：I~Ⅱ期23 例，Ⅲ~Ⅳ期19 例。所有患者活检前均未接受放化疗及其他治疗,同时，所有患者军签署知情同意书，并该研究获得该院伦理委员会批准。

1.2 方法

所有患者均抽取空腹静脉血4 mL，采用免疫组化染色法SP法进行检测，具体操作如下：将制作好的石蜡切片，置于恒温箱内60 ℃烘烤30 min，并浸入二甲苯溶液内脱蜡并水化；加入过氧化物酶阻断剂，室温孵育20 min，以抑制内源性过氧化物酶活，并采用柠檬酸缓冲液微波加热进行修复抗原；选用非免疫性动物血清封闭10 min，PBS 洗涤； 加入经抗体稀释液稀释至1∶100 的VEGF-C 兔抗人多克隆抗体，4 ℃孵育12 h，PBS 重复洗涤3 次；加入生物素标记的二抗，室温孵育20 min，PBS 重复洗涤3 次；滴加链亲和素-过氧化物酶溶液，室温孵育20 min；再经DAB 显色 （浓缩型DAB 试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司），苏木素复染，封片操作后，与荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 判定标准

采用染色阳性大肠癌组织切片为阳性对照片，阴性对照片以非免疫血清代替一抗。阳性表达为细胞膜或细胞质均呈棕褐色或棕黄色颗粒。将每一切片选择3 个视野，显微镜×400，每个视野计数100 个肿瘤细胞，共选择3 个视野的平均百分数进行结果判定[3]：①依据棕阳性黄色的面积及强弱判定：阴性：阳性细胞<10%；阳性：10%~50%；强阳：>50%。按阳性细胞百分率进行结果判定：0 分：<10%；1 分：10%~50%；2 分：>50%；②计分根据染色强弱：0 分：淡黄色；1 分：黄色；2 分：棕黄色。阴性：以上两项合计0~1 分；阳性：合计2~3 分；强阳性：合计4 分。

1.4 统计方法

运用SPSS17.0 统计学软件分析处理所得数据，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组患者VEGF-C 的表达比较

颈淋巴结转移组患者VEGF-C 表达阳性者34 例，阳性率达到80.95%，而鼻咽癌组患者中VEGF-C 表达阳性者20 例，阳性率仅为43.48%，组间对比发现，颈淋巴结转移组的阳性率显着高于鼻咽癌组，组间差异有统计学意义(χ2=13.004，P<0.05)，见表1。

表1 两组患者VEGF-C 表达比较[n（%）]

2.2 鼻咽癌组无淋巴结转移、伴有淋巴转移患者VEGF-C 表达

对于鼻咽癌组患者，按照有无淋巴结转移分组，各组间的VEGF，伴有淋巴结转移患者的VEGF-C 表达呈阳性者15 例，阳性率为57.69%，显着高于无淋巴结转移组10%（2 例），组间对比差异有统计学意义(χ2= 11.036，P<0.05)。见表2。

表2 鼻咽癌组无淋巴结转移与伴有淋巴结转移VEGF-C 表达比较[n（%）]

3 讨论

鼻咽癌是临床较为常见的恶性肿瘤，尤其在我国南部地区发病率较高，目前对于鼻咽癌的治疗仍多以放疗为主，但据统计发现，经放疗治疗后患者的五年生存率仅为50%左右，多数患者因复发或者远位转移而导致治疗失败[4]。颈部淋巴结转移是鼻咽癌转移的首发症状，占到鼻咽癌转移的60.30%~86.10%，且大多为双侧转移[5]。此外，颈部淋巴结转移往往发生在鼻咽癌早期，往往鼻咽部尚未发现病灶时，并可表现出颈部淋巴结转移[6]。因此，早期进行淋巴结转移的诊断和控制，对于鼻咽癌的预防和治疗具有重要意义。

VEGF-C 是目前研究发现的新的VEGF 家族成员，具有特异的淋巴管生成作用，逐渐被广泛关注。血管内皮生长因子VEGFC 被认为与肿瘤的新生淋巴管形成和淋巴结转移有密切关系。VEGFR-2、VEGFR-3 都是VEGF-C 的受体，促进机体的血管生成的原因是VEGF-C 与VEGFR-2 结合，促进机体淋巴管的生成则是VEGF-C 与VEGFR-3 结合[7]。目前，大多数恶性肿瘤如：肺癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、纤维肉瘤及恶性黑色素瘤等组织中VEGF-C 检测值均显着高于正常组织，VEGF-C 高表达与肿瘤淋巴管形成、淋巴结转移和患者的预后关系密切[8]。王文欢[9]等通过对32 例胃癌患者的VEGF-C 在胃癌组织中的表达及其与肿瘤淋巴结转移的关系研究中发现，胃癌组织VEGF-C表达明显高于正常胃组织，差异有统计学意义(P<0.01),且淋巴结转移组的VEGF-C 的表达与未转移组间差异有统计学意义(P<0.05)，表明胃癌细胞VEGF-C 高表达与淋巴结转移密切相关,可作为评估胃癌患者预后的重要参考指标。祝英杰[10]等通过对卵巢癌患者血清VEGF-C 水平与卵巢癌腹膜后淋巴结转移间的相关性研究发现，卵巢癌患者血清VEGF-C 水平明显高于良性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，以血清VEGF-C 浓度为2 400 pg/mL 作为分界值，血清VEGF-C>2 400 pg/mL 组的腹膜后淋巴结转移率高达77.78%，较血清VEGF-C ≤2 400 pg/mL 组（27.78%）显着降低，表明血清VEFG-C 水平能够有效预测卵巢癌腹膜后淋巴结转移。此外，李文光[11]等研究发现，鼻咽癌组织中VEGF-C 及其受体Flt-4 的阳性表达率显着高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且有淋巴结转移组的VEGF-C 阳性率显着高于未发现淋巴结转移组，表明VEGF-C 的高表达可能参与促进鼻咽癌的淋巴结转移。因此，检测VEGF-C 在鼻咽癌组织中的表达可能会在预测鼻咽癌颈淋巴结转移、 复发及评估预后等方面具有一定的意义,并可能为鼻咽癌提供新的治疗措施。

该研究结果也显示，鼻咽癌组中，伴有淋巴结转移患者的VEGF-C 阳性率为57.69%（15 例），显着高于无淋巴结转移组10%（2 例），差异有统计学意义(P<0.05)。同时，颈淋巴结转移组VEGF-C 阳性率为80.95%（34 例），显着高于鼻咽癌组43.48%（20 例），差异有统计学意义(P<0.05)，提示，VEGF-C 阳性率在鼻咽癌颈淋巴结转移患者组织表达值较高。田峰[12]等通过对鼻咽癌(NPC)患者外周血血清VEGF-C 表达水平的检测发现，鼻咽癌患者血清中VEGF-C 表达水平较良性疾病对照组、 健康对照组显着升高，差异有统计学意义（P<0.05），且淋巴结转移组高于无转移组，差异有统计学意义(P<0.05)，相关性分先发现两者间成正相关，差异有统计学意义(r=0.756，P<0.05)，结论与该研究相一致。此外，肖芸[13]等通过对26 例未化疗鼻咽癌淋巴结转移患者采用免疫组化发进行VEGF-C 检测，并将检测结果与未发生淋巴结转移的患者进行比较，发现转移组VEGF-C 阳性率显着高于未转移组。这些都表明鼻咽癌组织内VEGF-C 表达水平的升高，能够有效促进其向颈淋巴结的转移，但具体机制还需进一步的深入研究证实。

综上所述，鼻咽癌颈部淋巴转移患者的组织内VEGF-C 表达量显着升高，同时对于伴有淋巴结转移的鼻咽癌患者VEGF-C表达量也较未发生转移者升高，表明鼻咽癌患者组织中VEGF-C的表达与颈淋巴结转移具有一定的相关行，其检测可用于临床诊断鼻咽癌颈淋巴结转移。

[1] 陈睿,李刚,朱川,等.鼻咽癌患者血清VEGF-C 水平与淋巴管形成及临床疗效相关性研究[J].中国药房,2011（42）:3995-3997.

[2] 骆梅青, 李锡清.VEGF-C 和VEGFR-3 在鼻咽癌组织中的表达及其意义[J].实用癌症杂志,2010（6）:568-570.

[3] Uchida S, Shimada Y, Watanabe G, et al.In oesophageal squamous cell carcinoma vascular endothelial growth factor is associated with p53 mutation, advanced stage and poor prognosis[J].Br J Cancer,1998, 77(10):1704-1709.

[4] 姚平,林国彪,张锡流.鼻咽癌组织中VEGF-C、LYVE-1 表达与患者生存率的关系[J].广西医学,2012（2）:144-147.

[5] 张高明,侯文权,李志沭,等.鼻咽癌患者HIF-1α、VEGF-C、COX-2 和IL-10 表达研究[J].检验医学与临床,2010（24）:2728-2730.

[6] 王晓雪,王光明,潘云,等.VEGF 与鼻咽癌的研究现况及其临床意义[J].中国医学创新,2014（2）:149-151.

[7] 姚平,林国彪,张锡流.鼻咽癌组织中VEGF-C 表达与淋巴管密度的相关性分析[J].广西医学,2012（7）:807-809.

[8] 何艳屏,杨成章.鼻咽癌淋巴结转移的特点、诊断方法及治疗进展[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2010（9）:429-432.

[9] 王文欢,伍仁毅,孙国瑛,等.VEGF-C 和VEGF-D 在胃癌组织中的表达与淋巴结转移的关系[J].中南大学学报：医学版,2010（4）:335-340.

[10] 祝英杰,阮友琴,赵艳艳,等.血清VEGF-C 和CA125 联合检测对卵巢癌淋巴结转移的预测价值[J].肿瘤防治研究,2013（3）:278-281.

[11] 李文光,张娟,陈永平,等.鼻咽癌VEGF-C 和Flt-4 的表达与淋巴管生成及淋巴结转移的相关性[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2013（3）:196-198，203.

[12] 田峰,文道林,齐素文,等.鼻咽癌患者血清中VEGF-C 和CYFR21-1的表达及其与淋巴转移的关系[J].海南医学,2011（1）:11-12，6.

[13] 肖芸，李金高，黄传生.鼻咽癌VEGF-C、VEGFR-3 表达及淋巴管密度与淋巴结转移、复发及预后的关系[J].山东医药，2008,48（10）：91-92.