复方苦参注射液对人胃癌 BGC-823细胞株增殖抑制作用研究

李 珍,傅志泉,李春霞,周嘉鹤,胡甜甜

复方苦参注射液是由苦参、白茯苓及土茯苓等经加工制成的纯中药制剂,临床具有抑制肿瘤细胞生长、止痛、改善造血功能、增强化疗效果等作用,其临床报道较多,但有关作用于胃癌及其抗肿瘤作用机制研究却相对不足。本研究以人胃癌BGC-823细胞为研究对象,观察复方苦参注射液对其细胞增殖及凋亡的影响,探讨其作用机制,以期为复方苦参注射液治疗胃癌提供一定的实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人胃癌 BGC-823细胞购于中国医学科学院上海细胞生物研究所细胞库,其为贴壁型上皮细胞,建自于一位 62岁男性胃癌患者。

1.2 药物及试剂 复方苦参注射液由山西振东医药集团生产,国药准字 Z14021231Z14021230,5 ml/支;RPMI-1640培养液及 DNA标准分子量 3 000 bp(DNA分子量别为 3 000 bp、2 000 bp、 1 000 bp、 750 bp、 500 bp、 250 bp、 100 bp)为杭州吉诺生物医药技术有限公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;噻唑兰及二甲基亚砜 (DMSO)为Amresco分装;PI试剂盒为美国 BD公司产品;公司琼脂糖粉为 Agarose分装;细胞凋亡 DNA-ladder提取试剂为北京博大泰克生物基因技术有限责任公司产品。

1.3 细胞培养 常规复苏人胃癌 BGC-823细胞株,按贴壁方法培养,细胞培养在经过 0.22μm滤膜过滤的 RPMI-1640培养液中 (含 10%热灭活血清,青霉素 100 U/ml和链霉素100μg/ml),在 37℃、5%的 CO2、饱和湿度下进行培养,用PBS配制的 0.15%的胰蛋白酶 (含有 0.02%的 EDTA)消化细胞传代,每周可以传代1～2次,收集指数生长期 BGC-823细胞用于实验研究。

1.4 四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定细胞增殖抑制率实验用 96孔培养板内加入 5×104个/ml的单细胞悬液,每孔加入 20μl培养液,37℃、5%CO2孵箱中培养 24 h,加入终浓度分别为原液浓度 1/200.0、1/100.0、1/50.0、1/25.0及1/12.5的复方苦参注射液作用于人胃癌 BGC-823细胞,每一浓度设 6个复孔,对照组加入等体积的无血清 RPMI-1640培养液,继续培养 48 h后,1 000 r/min,10 min,弃去上清,每孔加入无血清 RPMI-1640培养液 200μl,每孔再加入 MTT(5 mg/ml)20μl,继续孵育 4 h,离心去上清,每孔加入 DMSO200μl,同时设 DMSO空白对照,6个复孔。振荡溶解结晶,在 570 nm波长比色 (Wallac酶标仪),实验重复 3次,取平均值为最终结果。按下列公式计算抑制率:细胞抑制率 =[(对照组 OD值 570-给药组 OD值 570)/(对照组 OD值570-本底组 OD值 570)] ×100%计算,并采用 Logit法计算出复方苦参注射液作用人胃癌BGC-823细胞48 h细胞生长抑制 50%,即 48 h半数抑制浓度 (IC50)值。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 参照试剂盒说明书操作。人胃癌 BGC-823细胞以 5×105/ml的单细胞悬液接种 6孔培养板,加入复方苦参注射液 (终浓度为 1/25.0原液稀释倍数)作用人胃癌 BGC-823细胞 24 h、48 h及 72 h后,同时设空白对照组,收获细胞,1 500 r/min,离心 5 min,冷 PBS洗 3次后弃上清液,用预冷75%乙醇固定,4℃保存。临用前固定细胞悬液离心,加预冷 PBS2 ml,2 000 r/min,5 min,洗 2次,调整细胞浓度至 1×106/ml,加入 RNase A(10 mg/ml)100 μl混匀,室温孵育 10 min,加入碘化丙啶染液 (PI,50μg/ml)800μl混匀,4℃避光放置 30 min后流式细胞仪检测分析,CellQuest 3.3软件获取直方图,MulticyCle软件分析亚二倍体峰及细胞凋亡率。

1.6 细胞 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 收集经复方苦参注射液 (终浓度为1/25.0原液稀释倍数)作用 48 h及72 h后的及正常培养的人胃癌 BGC-823细胞各 1×106个,用细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒抽取细胞 DNA,严格按试剂盒提供步骤操作,取 10μl DNA样品与上样缓冲液混匀,于 2%琼脂糖凝胶低电压电泳 (1 V/cm),在紫外灯下观察并记录 DNA电泳情况。

1.7 统计学方法 采用 SPSS 13.0统计软件进行处理,计量资料采用表示,采用 t检验;相关指标用 one-way ANOVA分析,以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色法测定细胞增殖抑制率 不同浓度复方苦参注射液对人胃癌 BGC-823细胞48 h生长抑制率比较,差异有统计学意义 (p＜0.05,见表1)。复方苦参注射液能明显抑制人胃癌 BGC-823细胞生长,且有浓度依赖关系。IC50为 9/250原液稀释倍数。

表 1 复方苦参注射液对人胃癌 BGC-823细胞 48 h生长抑制作用Table 1 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell proliferation for 48 hours

表 1 复方苦参注射液对人胃癌 BGC-823细胞 48 h生长抑制作用Table 1 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell proliferation for 48 hours

组别 药物浓度 (剂量/原液稀释倍数) 抑制率 (%)对照组 0 0复方苦参注射液 1组 1/200.0 10.74±2.51复方苦参注射液 2组 1/100.0 19.13±4.78复方苦参注射液 3组 1/50.0 44.12±3.99复方苦参注射液 4组 1/25.0 54.19±2.18复方苦参注射液 5组 1/12.5 65.13±2.72

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 凋亡细胞的 DNA荧光强度降低,在 G0/G1峰前出现一个小于 DNA二倍体含量的亚二倍体峰,即细胞凋亡峰 (Sub-G1)。加入复方苦参注射液 (终浓度为 1/25.0原液稀释倍数)作用人胃癌 BGC-823细胞 24 h、48 h及 72 h,PI染色流式细胞仪检测其细胞凋亡率分别为(9.58±0.88)%、(20.41±0.77)%及 (60.30±3.19)%,空白对照组为 (4.17±0.11)%,各组与对照组比较差异均有统计学意义 (p＜0.05),并出现明显的 Sub-G1(见图1)。

图 1 复方苦参注射液作用于人胃癌 BGC-823细胞PI染色细胞凋亡率Figure 1 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell apoptosis rate of PI

2.3 细胞 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 复方苦参注射液 (终浓度为 1/25.0原液稀释倍数)作用于人胃癌 BGC-823细胞48 h及72 h后,抽提 DNA,在琼脂糖凝胶电泳可见 DNA断裂成 180～200 bp及其倍数的片断梯形条带,空白对照则未见此现象 (见图 2)。

图 2 复方苦参注射液作用于人胃癌 BGC-823细胞 DNA琼脂糖凝胶电泳Figur e 2 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell agarose gel electrophoresis of DNA

3 讨论

胃癌是人类常见的恶性肿瘤,我国是胃癌高发国家,其发病率和死亡率居各种恶性肿瘤首位[1],严重威胁着人类的健康,因此对其防治的研究具有重要的临床意义。现代医学研究表明,细胞过度增殖与凋亡的阻遏是肿瘤的基本特征,随着基因研究的深入,已经证实胃癌发生、发展、转移、血管生成、耐药性和预后等都与细胞凋亡有一定关系。因而抗肿瘤药物的作用途径之一就是诱导肿瘤细胞凋亡。

复方苦参注射液是以苦参、白茯苓和土茯苓等为原料经科学提炼而制成的注射剂,其主要有效成分为氧化苦参碱、槐定碱、苦参碱等[2-3],苦参清热燥湿,茯苓清热解毒。实验研究证明复方苦参注射液及其成分苦参碱、氧化苦参碱等对多种肿瘤细胞如 SGC7901、HepG2和 BEL27402等有直接杀伤作用[4]。该药在实验研究及临床应用中被发现具有良好的抑制肿瘤的作用,其对肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤细胞增殖均有抑制作用,联合化疗可减毒增效,提高临床抗肿瘤的疗效[5-8]。

本研究结果表明,复方苦参注射液对人胃癌 BGC-823细胞具有明显的增殖抑制作用,呈现量效关系。通过流式细胞仪检测分析,复方苦参注射液作用人胃 BGC-823细胞 24 h、48 h及 72 h后,凋亡细胞百分数逐渐增多并出现明显的 Sub-G1,且 DNA琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯状条带,这种典型改变是细胞凋亡的可靠指标,可见复方苦参注射液能够抑制胃癌 BGC-823细胞增殖并诱导其凋亡,其具体作用机制还有待于进一步研究,以期为复方苦参注射液应用于临床治疗胃癌提供一定的实验依据和理论基础。

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4 李芮,杜健鹏,侯仰韶,等 .复方苦参注射液对 SGC27901,HepG2和BEL27402肿瘤细胞作用的实验研究 [J].肿瘤研究与临床,2006,18(1):8-10.

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