188Re放射性锡胶体对恶性腹水模型小鼠的治疗作用

金永男窦宇聂俊杰许秉全

188Re放射性锡胶体对恶性腹水模型小鼠的治疗作用

金永男①窦宇②聂俊杰①许秉全①

目的：探讨和评价188Re（铼）标记的锡胶体对恶性腹水动物模型的治疗效果。方法：制备188Re-锡胶体按试剂盒说明书操作，标记率通过色谱法利用放射性薄层扫描仪检测。在体外培养小鼠肉瘤180细胞5×106/0.3 mL注射到ICR小鼠腹腔内建立恶性腹水动物模型。培养3 d后实验组分3个剂量组，分别为188Re-锡胶体37组、18.5组和9.25 MBq/mL组。对照组为恶性腹水小鼠腹腔内注射生理盐水组、正常ICR小鼠腹腔内注射37 MBq/mL 188Re-锡胶体组和正常ICR小鼠组，每组均12只。注射锡胶体3、24 h和48 h后用γ相机分不同时间采集小鼠腹腔内放射性分布图像，然后收集腹腔积液通过免疫印迹法检测Bax蛋白的表达情况，同时取腹腔主要脏器评价腹腔脏器的组织病理学变化。注射锡胶体后每隔2 d进行体重和生存时间的监测，共观察80 d。统计学处理采用SPSS 10.7版软件进行统计学分析，生存时间分析采用kaplan meir统计学方法，组间比较采用log Rank方法。结果：188Re-锡胶体的标记效率均为99%以上。注射锡胶体3、24 h和48 h后用γ相机采集的小鼠腹腔内放射性分布图像显示，放射性胶体均匀分布在小鼠腹腔内无腹腔外漏出。188Re-锡胶体处理的实验组与生理盐水处理的对照组相比肿瘤细胞Bax蛋白的表达明显增加；腹腔脏器的组织病理学检测结果也显示，188Re-锡胶体处理的小鼠与生理盐水处理的小鼠相比，出现肝细胞变性，脾白髓萎缩，中性粒细胞浸润，肠细胞粘连，胃腺体退化等改变。注射37 MBq/mL 188Re-锡胶体的两组小鼠初期与其他各组相比具有体重下降趋势，但随后8～10 d开始体重逐渐增加，各组间未见明显差异（P＞0.05）。188Re-锡胶体注射后80 d生存率分析结果显示，37、18.5和9.25 MBq实验组生存时间分别为（59.0±8.5）d、（63.6±7.1）d、（54.8±7.0）d，与生理盐水组（20.0±1.9）d相比，均明显延长（P＜0.001）。结论：188Re标记的放射性锡胶体不仅物理性能好，而且对恶性腹水疗效佳，副反应小，为临床治疗恶性胸、腹水提供了更多的选择。

恶性腹水； 188Re-锡胶体； 动物模型

恶性腹水是消化系统肿瘤或卵巢癌等通过血管和淋巴管发生转移、肿瘤组织溃破浆膜层或根治术后也常因癌细胞脱落腹腔发生种植性转移。一般患者出现恶性腹水时多为癌症中晚期、体质较差，外科手术、全身化疗和放疗效果也不理想。放射性核素标记的胶体腹腔内灌注治疗恶性腹水具有疗效好、持续时间长和副作用小等特点，广泛应用于临床[1-4]。常用的放射性胶体是198Au和32P标记的放射性胶体，然而放射性核素198Au和32P的物理特征不适合临床应用。放射性核素188Re半衰期17 h，发射高密度的高能β射线（Emax=2.12 MeV），其组织内平均射程为3.8 mm，而且利用它发射（15%、155 KeV）的γ光子，通过ECT等显像设备获得体内放射性胶体的分布图像。无载体188Re可以从188W/188Re核素发生器获得，更适合临床使用[5-10]。因此，188Re标记的治疗用放射性药物的研究逐渐增加，有些药物已应用于肝癌、关节炎和骨转移癌的治疗[11-15]。188Re标记的腔内治疗用放射性胶体有硫胶体和锡胶体。然而，有研究报道称，188Re标记的硫胶体在使用过程中，注射器或其他管壁残留放射性较高，使得难以预测注射剂量，并导致产生多余的放射性废物[12]。因此，本实验通过建立恶性腹水的动物模型，利用188Re标记的锡胶体评价其恶性腹水的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肉瘤180细胞、188Re-锡胶体试剂盒（韩国首尔大学医科大学附属医院核医学科实验室提供）；ICR小鼠（日本SLC提供）；188W/188Re核素发生器（美国橡树岭国家实验室提供）；放射性薄层扫描仪（美国Imaging Scanner system 2000，BIOSCAN）；Bax抗体（美国Santa Cruz Biotech公司）；γ相机（美国ON 410；Ohio Nuclear）。

1.2 方法

1.2.1 制备188Re 锡胶体 188Re-锡胶体标记按说明书操作，将从188W/188Re核素发生器淋洗下来的新鲜188Re淋洗液（～1110 MBq）、0.1 mol/L HCl 0.2 和0.8 mL的分别加到小瓶中，并沸水孵育2 h，冷却后用0.2 mol/L磷酸钠缓冲液（pH=8）进行中和，离心弃去上清液加生理盐水。标记率通过色谱法（ITLC-SG/生理盐水）利用放射性薄层扫描仪检测。放射性胶体颗粒大小和稳定性由国立首尔大学医科大学附属医院核医学科预先进行检测[12]。

1.2.2 细胞培养 将肉瘤180细胞接种于含10%小牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。

1.2.3 动物模型的建立及实验分组 在体外培养的肉瘤180细胞5×106/0.3 mL注射到ICR小鼠腹腔内，3 d 后188Re-锡胶体注入到ICR小鼠腹腔内。其剂量按每30 g体重ICR小鼠分别为37、18.5和9.25 MBq/mL，每组均12只。对照组分别为恶性腹水小鼠腹腔内注射生理盐水组（第4组）、正常ICR小鼠腹腔内注射37 MBq/mL 188Re-锡胶体组（第5组）和正常ICR小鼠（第6组），每组均12只。

1.2.4 图像采集 小鼠腹腔内注射锡胶体3、24和48 h后，使用针孔准直器的γ相机，不同时间采集小鼠腹腔内放射性分布图像。

1.2.5 Bax蛋白的检测及腹腔脏器组织病理学检测 收集腹腔积液按常规免疫印迹法检测Bax蛋白的表达情况，同时取腹腔主要脏器检测腹腔脏器的组织病理学变化。

1.2.6 疗效评价 小鼠腹腔内注射188Re-锡胶体后，每隔2 天进行体重和生存时间的监测，共观察80 d。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.7版软件进行统计分析，生存时间分析采用kaplan meir统计学方法，组间比较采用log Rank方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标记率及稳定性 188Re-锡胶体的标记效率均为99%以上。预先检测的188Re-锡胶体的稳定性，无论在体外常温下放置24 h还是37 ℃血清培养液放置72 h，其放射化学纯度未见变化。

2.2 放射性胶体腹腔内分布图像 注射锡胶体3、24 和48 h后用γ相机采集的小鼠腹腔内放射性分布图像，发现放射性胶体均匀分布在小鼠腹腔内，未发现明显的腹腔外放射性分布（图1）。

图1 腹腔内注射188Re-锡胶体后不同时间段获得的188Re-锡胶体腹腔内胶体分布图像

2.3 Bax蛋白检测及腹腔脏器组织病理学检测 188Re-锡胶体处理的实验组与生理盐水处理的对照组相比，肿瘤细胞Bax蛋白的表达明显增加（图2）；腹腔脏器的组织病理学检测结果也显示，188Re-锡胶体处理的小鼠与生理盐水处理的小鼠相比，出现肝细胞变性，脾白髓萎缩、中性粒细胞浸润，肠细胞粘连，胃腺体退化等改变。

图2 恶性腹水小鼠模型腹腔内注射188Re-锡胶体48 h后通过免疫印迹法检测肿瘤细胞内Bax蛋白的表达情况

2.4 疗效评价 注射37 MBq 188Re-锡胶体的两组小鼠体重初期与其他各组相比，体重有下降趋势，但随后8～10 d开始体重逐渐增加，各组间未见明显差异（图3）。188Re-锡胶体注射后80 d生存率分析结果发现，37、18.5和9.25 MBq实验组生存时间分别为（59.0±8.5）d、（63.6±7.1）d、（54.8±7.0）d，与生理盐水组（20.0±1.9）d相比，均明显延长（P＜0.001），见图4。

图3 恶性腹水小鼠模型腹腔内注射188Re-锡胶体后实验及对照组小鼠体重变化情况

3 讨论

放射性核素标记的胶体广泛应用于类风湿关节炎、恶性腹水和胸腹腔内微小转移灶的预防与治疗[1-8]。放射性胶体属惰性物质，本身无药理作用。注入体内后不溶解于体液，因而不被吸收，大部分停留在注射部位，或均匀地附着在体腔内壁和肿瘤组织表面，或被肿瘤近旁淋巴管及淋巴结中的网状内皮系统吞噬细胞所吞噬，使放射性胶体较多地浓聚在肿瘤病灶中或其周围。标记核素放出的β射线近距离照射可对渗出液内的游离癌细胞和散播在浆膜表面的微小病灶进行照射，直接杀死癌细胞，也能直接破坏浆膜表面粟粒样转移灶使其趋向纤维化，还可促使内皮下层纤维化，局部血管和淋巴管闭塞，以及浆膜脏层和壁层黏合而使渗出液减少。但对邻近器官无明显影响，很少出现全身反应，可提高患者生活质量并延长生存时间[2，16]。

图4 恶性腹水小鼠模型腹腔内注射188Re-锡胶体后实验及对照组小鼠的生存曲线

然而，放射性胶体颗粒大小和核素的物理特征直接影响腹腔内放射性胶体的生物分布和疗效。本研究所使用的188Re-锡胶体发射高密度高能β射线以及适合ECT显像的γ射线，而且胶体颗粒大小（＞1 μm，占94.8%）也适合腔内核素治疗。本研究结果也显示，注射锡胶体48 h后仍大量放射性胶体均匀分布在小鼠腹腔内，未发现腹腔外漏出，而且生存时间分析结果也证明，实验组的三组小鼠生存时间与对照组相比，明显延长其生存时间，尤其是注射18.5 MBq的实验组生存时间最长（P＜0.001）。细胞凋亡相关蛋白Bax分析结果显示，随着放射性胶体剂量的增加Bax蛋白表达也相应增高，说明辐射生物效应主要决定其疗效。正常小鼠腹腔内注入胶体37 MBq后第28天一只小鼠死亡，而且注入放射性胶体的小鼠体重与正常对照组相比，随着放射性剂量的增加开始下降越明显，随后体重逐渐增加各组间未见明显差异，考虑可能与放射毒性及辐射生物效应有关，这些变化与腹腔脏器的组织病理学结果相符。小鼠腹腔内或各脏器的辐射剂量的检测，其方法比较复杂以及实验动物等条件限制，本研究未能检测吸收剂量等指标，是本研究的不足之处，需要进一步探讨。

总之，188Re标记的放射性锡胶体不仅物理性能好，取材和制备容易，而且疗效佳，副反应小，可以为恶性胸、腹水的治疗提供了更多的选择。同时本研究在核素和胶体的选择以及决定剂量等方面进行了对比分析，为临床进一步推广提供理论依据。

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The Therapeutic Effect of 188Re-tin colloid（TC） on the Treatment of Malignant Ascites Model Mice

J IN Yong-nan，DOU Yu，NIE J un-jie，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（24）：024-027

Malignant ascites； 188Re-tin colloid； Animal model

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.24.008

2014-05-26） （本文编辑：欧丽）

①吉林省吉林市人民医院 吉林 吉林 132001

②一汽总医院

许秉全

【Abstract】 Objective：To investigate and evaluate the therapeutic effect of 188Re-tin colloid （TC） in animal models with malignant ascites.Method：188Re-TC colloid was prepared according to kit instruction，and labeling efficiency was determined by chromatography using radioactive thin-layer scanner.The animal models with malignant ascites were established through injecting 5×106/0.3 mL sarcoma180 cells，cultured in vitro，into abdominal cavity of ICR mice.The experimental animal models were divided into 3 different dose-groups after 3 day of culture，that were 37，18.5 and 9.25 MBq/mL of 188Re-TC respectively.The control groups were also divided into 3 groups，12 mice in each group，which included （1）the mice of malignant ascites by intraperitoneal injection of saline；（2）the normal ICR mice by intraperitoneal injection of 1 mCi/mL 188Re-TC；（3）the normal ICR mice without any treatment.Different collection times of intraperitoneal radioactive distribution images in mice were captured by gamma camera at 3，24 h and 48 h post injection.Then peritoneal effusion was collected to detect the expression of Bax protein by western blotting method，while the major abdominal organs were also collected to evaluate histopathological changes.After injection of 188Re-TC，the body weight and survival time of mice were monitored every two days and observed 80 days in all. Statistical analysis was performed with SPSS （version 10.7）.Survival analysis was calculated by Kaplan Meir statistical methods，difference among groups was compared by log Rank method.Result：Labeling efficiency of the 188Re-TC was higher than 99%.Homogeneous distribution of radioactivity in the abdomen was found in 3，24 and 48 h images of treated mice without abdominal intraperitoneal leakage.Dose-dependent expression of Bax protein was confirmed.Histopathological analysis showed that mice treated with 188Re-TC，compared to the ones treated with saline，expressed more in the liver cell degeneration，spleen white pulp atrophy，neutrophil infiltration，intestinal cell adhension，degradation of gastric glands，and so on.Two groups of mice injected with 1 mCi/mL 188Re-TC showed a trend to loss body weight at the beginning，compared with the other groups，but then the body weight of them gradually increased after 8-10 days，and there was no significant difference between groups（P＞0.05）.Survival analysis results in 80 days after 188Re-TC injection showed that the survival time of 37，18.5 and 9.25 MBq/mL group were （59.0±8.5）d，（63.6±7.1）d and （54.8±7.0）d respectively，and were significantly increased compared with the saline group [（20.0±1.9）d]（P＜0.001）.Conclusion：188Re-TC not only has the better physical properties，but also holds the good curative effects on malignant ascites with less side-effects，which may provide more choice for malignant pleural effusion and ascites.

First-author’s address：The People’s Hospital of J ilin City，J ilin 132001，China