邓鹏程，王岐本，邝满元，徐 松
(湘南学院基础医学部解剖教研室，湘南郴州 423000)
环介导等温扩增法在常见性病病原体检测中的应用*
邓鹏程，王岐本，邝满元，徐 松
(湘南学院基础医学部解剖教研室，湘南郴州 423000)
环介导等温扩增法； 常见性病； 病原体检测
20世纪70年代后期,性病在我国一些地区死灰复燃,发病地区不断扩大,发病人数直线上升,危害日益严重,从沿海到内地,从城市到农村,从社会到家庭,性病疫情逐步扩散蔓延。据2002年全国对7种常见性病：非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣、生殖器疱疹、梅毒、淋病、软下苷、性病淋巴肉芽肿累计报道为 744 848例，发病率为58.15/10万。另外由于各种原因的漏诊和漏报，中国疾病预防控制中心性病麻风病防治中心的调查结果显示，性病实际发病数是报告数的10～20倍。世界卫生组织估计，我国每年实际新发性病例数为1 600～2 000万[1]。近十几年来，中国性病发病率每年以20%至30%速度增加，性病已成为五大传染病之一,给社会和人民都带来了严重的危害。为防治和控制性传播疾病,对性病病原体的准确快速检测意义重大。传统的性病检测法大多繁琐费时，不利于性病的早期诊断以及及时控制，因此开发一系列能应用于基层医疗机构的性病病原体检测方法成为当务之急。近年来发展的环介导等温扩增法(LAMP)因为具有特异、敏感及操作简便等特征已用于各种病原体的检测。本研究探讨LAMP在常见性病病原体检测中的可行性及应用前景进行分析，报道如下。
1 传统的性病病原体检测法
1.1 涂片镜检法 涂片镜检法一般是直接将各种分泌物及体液标本涂片后，通过革兰染色或巴氏染色后进行显微镜下观察判定。该方法简单、易操作，成本低，对实验要求不高，多用于男性急性淋病的诊断。女性宫颈和阴道中杂菌很多，有的杂菌很像淋球菌，给诊断造成困难，出现较高的假阳性率。针对沙眼衣原体的检查，常用姬姆萨染色法和碘染色法，但敏感性不高。更重要的是此方法对医生的经验要求较高,镜检结果以主观判断为主,容易造成误诊和漏诊,检测结果阳性率不高,特别是在基层医院很难较好地应用[2]。
1.2 免疫学检测法 20世纪80年代以来，免疫学检测法广泛运用于性病检测中，其基本原理是将某种发光剂或其衍生物加入到一个免疫反应体系中，在酶的催化作用下发光，可以根据发光强度来计算待测抗原或抗体的量。加入发光增强剂后，持续时间延长，可以重复测量，方法灵敏、准确。如何红霞等[3]以人工合成的人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 gp41.1(sp1)等5条多肽,采用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)原理建立检测抗HIV-1P2总抗体的双抗原夹心ELISA。该实验通过检测卫生部药品生物制品检定所提供质控参比血清,发现其特异性和灵敏度均为100%。其优点是特异性强、敏感性高,操作简便快捷,适合于献血者大范围筛选，缺点是免疫学检测方法在新感染或未产生高抗体滴度的人群中敏感性较低，IgG基因突变可影响检出率，IgG抗体产生的延迟性会影响早期诊断和及时治疗。
1.3 聚合酶链反应(PCR) 20世纪90年代以后，随着分子生物学检测方法的发展，性病病原体的各种分子生物学检测方法也应运而生，主要方法有：PCR、连接酶链反应技术基因芯片、Gene Chip技术、蛋白芯片技术等。其中PCR应用较为广泛，PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。随着微生物基因组学的发展,PCR在感染性疾病检测和诊断中的应用日趋广泛,特别是在致病微生物，如病毒、细菌、衣原体、支原体、螺旋体等引起的性病感染DNA 检测应用较广。PCR检测技术较之传统方法有许多优点,但其费用昂贵、易受污染，其假阳性尤其是一个主要需要考虑的问题。由于需要昂贵的PCR等仪器和高技术要求，该技术在基层医疗机构尚未开展病原体的核酸检测。
总之，目前临床针对性病病原体传统检测方法既有优势，也有许多不足，而在此基础上开发针对性病病原体的快速且准确的检测方法对防治和控制我国日益严重的性传播疾病意义重大。
2 LAMP在性病病原体检测中的应用
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世界卫生组织、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于严重急性呼吸道综合征、禽流感、艾滋病等疾病的检测中。LAMP具有以下几个优势：(1)等温高效。相比于常规PCR利用高温使双螺旋解链变性成单链进行热循环，NASBA和3SR则使用一系列转录和反转录过程来循环以避免高温变性作用，SDA则使用限制性内切酶和修饰过的模板来循环扩增。虽然它们的敏感性都很高，可以检测并扩增小于10个拷贝的核酸样本，但是它们还有各自需要克服的缺点。技术要求、材料仪器要求、技术本身特异性缺陷等方面严重束缚了这些技术的推广应用。LAMP则在这些方面有所突破。(2)有较高的特异性和抗干扰能力。当2对引物与目的基因片段的6个区域匹配上就能进行扩增。非目的基因片段对LAMP反应的干扰比小，这方面比PCR强。LAMP的反应体系比较稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定并且对于样品中原有或污染的干扰基因片段仍然不敏感，而其他反应体系则无法做到这一点。(3)敏感性较高。可以以单拷贝的基因为模板进行扩增。(4)反应过程简单快速且高效。能够在1 h内将单拷贝的基因模板扩增到109个拷贝，这一过程是在60～70 ℃的恒温下进行的。只需一台恒温箱即可,不需受昂贵仪器的束缚。另外LAMP结果的检测也无需仪器，这些在一定程度上降低了实验的操作成本。只要引物设计正确，并且完善各种反应条件之后，LAMP对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，在野外工作时也能达到。
随着LAMP的发展，它已成功应用于细菌、病毒、支原体、真菌、寄生虫、乙型肝炎病毒检测等[4]。最近，国内、外专家也将其应用于各种性病病原体的检测当中。
2.1 LAMP在艾滋病病毒检测中的建立 2009年Hosaka等[5]利用RT-LAMP对HIV-1M组进行检测，在60 ℃的等温条件下，扩增反应在35 min内即可完成，其检测限可以达到120 copy/mL。该试验对从艾滋病高发区——西非的喀麦隆所收集的57例感染HIV-1的患者和40例未感染HIV-1的居民体内血浆样本进行RT-LAMP分析，结果发现，57例感染HIV-1的患者血浆样本中有56例带有HIV-1M组的血样本，例如图标类型A、B、G、F2,以及循环重组形式(CRFs)_01、_02、_09、_11、_13都被检测为阳性。针对一个带有HIV-10组及40例未感染HIV-1的血浆样本分别进行检测，结果皆显示为阴性。这些发现证明了RT-LAMP对血浆样本中含有的HIV-1M RNA的检测快速且灵敏，而且具有特异性。这些数据也说明了LAMP在艾滋病病毒的诊断中是可行的，特别适宜于资源条件不足的环境。
2.2 LAMP在淋球菌检测中的建立 崔亚利等[6]利用 Primer Explorer V3软件分别针对淋球菌porA及16S rRNA基因设计2条内引物 FIP、BIP，2条外引物F3、B3，2条环引物LF、LB，共6条引物，以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板，进行LAMP扩增。同时，以外引物F3、B3 为PCR引物，进行PCR扩增，并比较两种扩增方法的灵敏度和特异性，探讨LAMP用于淋球菌感染早期诊断的可行性。他们经过试验得出结果：LAMP 与PCR灵敏度相同，可检测到10个拷贝的目的基因；其针对淋球菌porA和16S rRNA基因的引物对脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和大肠埃希菌的 DNA均不能扩增，其试验成功建立了检测淋球菌 porA和16SrRNA基因的LAMP。他们认为与PCR相比，LAMP不需要使用PCR仪等昂贵、精密的仪器设备，避免了DNA的热变性，长时间的温度循环，一级产物后续检测等步骤，更为快速，且操作简便，检测成本更低，为淋球菌的快速检测提供了新的手段，有望成为淋球菌常规检测的简便方法。
2.3 LAMP在沙门菌检测中的建立 沙门菌病也属于一种常见的性病，叶宇鑫等[7]以沙门杆菌为研究对象,探讨了将原位荧光LAMP应用于检测沙门菌所需要的具体实验方法与数据,成功将原位荧光LAMP应用于检测人工污染食品中的沙门菌。该试验选取invA基因作为靶序列设计了2对引物进行LAMP扩增。结果显示，与PCR相比,LAMP扩增无需破碎细胞提取DNA,操作简便，反应过程耗时少;反应条件恒温便可,基因检测水平证明LAMP扩增产物高度特异性;根据反应结果颜色变化肉眼便可作出判断。
3 LAMP在性病病原体检测中的应用展望
与传统性病病原体检测法相比，LAMP具有明显优势。首先，LAMP经济实用，不需要昂贵的PCR仪，对于中、小医院只需要一台恒温水浴箱即可。其次，LAMP最大的优势就在于操作的简便性及对仪器设备和人员要求不高，人员只需简单培训即可，最适合基层医院和场外应用。LAMP操作步骤简单，只需按反应体系要求加入反应液、酶、引物及模板于PCR管中，于恒温箱反应45 min左右，经肉眼观察反应管颜色是否变为白色浑浊就能判断结果。另外，LAMP高效快速,LAMP不需要扩增产物双链DNA热变性，避免了温度循环从而节省大量时间，核酸在1 h内便可完成扩增，从而快速检测到扩增产物，在性病检测中应用能达到快速诊断的目的。与免疫学检测方法相比，LAMP能更为精准，因为其能扩增出病原体基因的特异性梯状条带。与涂片镜检法相比，LAMP省时省力、不易漏诊、检测结果更具客观性。如果研发相关性病基因检测试剂盒，LAMP有望成为性病常规检测的简便方法，为基层医院进行性病检测创造有利条件，同时为患者提供快速、准确的检测，在防治与控制性疾病的传播中发挥重要作用。
[1]张红兵，李琦，马骏，等．我国性病流行现状及应对措施[J]．中国国境卫生检疫杂志，2004，27(6)：377-380．
[2]何江，仇东辉，余伍忠，等．性传播疾病实验检测综述[J]．中国优生与遗传杂志，2004，12(5)：139-140．
[3]何红霞，貌盼勇，侯俊，等．双抗原夹心法检测抗HIV-1/2总抗体方法的建立和评价[J]．中华实验和临床病毒学杂志，2002，16(3)：288-291．
[4]张如胜，魏泉德．LAMP技术在病原微生物检测中的应用[J]．华南预防医学，2007，33(5)：45-49．
[5]Hosaka N,Ndembi N,Ishizaki A,et al.Rapid detection of human immunodeficiency virus type 1 group M by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay[J].J Virol Methods,2009,157(2):195-199.
[6]崔亚利，何於娟，刘鑫，等．快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增技术的建立[J]．中国生物制品学杂志，2010，23(10)：1125-1128．
[7]叶宇鑫，李琳，山崎伸二，等．原位荧光LAMP技术检测食源性沙门氏菌[J]．食品与发酵工业，2009，35(3)：137-142．
湖南省高等学校2010年科学研究项目(10C1240)。
10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.061
B
1672-9455(2015)03-0425-03
2014-08-30
2014-10-20)
