长春西汀对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用*

孔晓君，王晓梅，高 鑫，李建远(.宁夏医科大学检验学院,银川 750004；.烟台大学生命科学学院，山东烟台 64005;3.烟台毓璜顶医院中心实验室，山东烟台 64004)



长春西汀对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用*

孔晓君1，王晓梅1，高 鑫2，李建远3△(1.宁夏医科大学检验学院,银川 750004；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005;3.烟台毓璜顶医院中心实验室，山东烟台 264004)

目的 探讨长春西汀对小鼠肾缺血再灌注(IR)损伤的保护作用及其作用机制。方法 将48只健康小鼠分成假手术组、IR组、长春西汀低剂量干预组和长春西汀高剂量干预组，采用双侧肾蒂夹闭45 min的方法建立小鼠肾IR损伤模型，HE染色后观察肾脏组织形态学变化，测定再灌注24 h后各组血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平，观察肾脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果 与假手术组相比，IR组出现肾小管管腔扩张,刷状缘消失，管腔内有管型等病理改变，血清中SCr、BUN、TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，肾组织SOD活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，MDA水平升高，差异也有统计学意义(P<0.05)；与IR组相比，长春西汀10 mg/kg和20 mg/kg干预可呈剂量依赖性改善肾组织病理损伤，SCr、BUN、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平减少，使肾组织SOD活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 长春西汀可通过抑制炎症和氧化应激来减轻肾IR损伤。

长春西汀； 肾缺血再灌注损伤； 炎症因子； 氧化应激

肾缺血再灌注(IR)是一常见的临床问题，肾移植、肾部分切除术、肾部分血管成形术、休克复苏等均可造成不同程度的肾IR损伤，是造成急性肾衰竭和移植肾功能恢复延迟的主要原因。其病理损伤机制比较复杂，主要涉及氧化应激、炎症因子的释放和细胞凋亡等[1]。长春西汀是从夹竹桃科小蔓长春花提取的生物碱，临床上一直用于缺血性脑血管疾病的治疗和预防，它在脑、肝等IR损伤中的保护作用已被报道，但其在肾IR的作用还是未知的[2-3]。本研究旨在探讨长春西汀在肾IR损伤中的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性昆明白小鼠，体质量30～40 g(滨州医学院动物实验中心)。长春西汀注射液购自山东瑞阳制药有限公司。小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 酶联免疫吸附试验试剂盒购自达科为生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白水平测定试剂盒购自烟台赛尔斯生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型制备 将小鼠分成4组：(1) 假手术组(n=8)；(2)IR组(n=8)；(3)长春西汀低剂量干预组(n=8)；(4)长春西汀高剂量干预组(n=8)。小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10 mg/kg)腹腔麻醉后仰卧在手术台上，腹部备皮、消毒后正中切口，游离左右肾蒂，假手术组不夹闭，其余3组分别用无损伤血管夹夹闭，45 min后松开恢复血流，以肉眼观察肾脏颜色变化来判断肾脏缺血或再灌注是否成功。长春西汀低剂量和高剂量干预组分别在术前1 h腹腔注射长春西汀10 mg/kg和20 mg/kg；假手术组和IR组同时给予等量生理盐水。再灌注24 h后打开腹腔，下腔静脉取血分离血清，取一部分肾组织Bouin氏液固定，剩余肾组织用冰磷酸盐缓冲液漂洗后-70 ℃保存。

1.2.2 组织学评价 取小鼠肾组织，Bouin氏液固定24 h，常规制备石蜡切片，脱蜡水化后用HE试剂盒染色，光镜下观察肾脏的组织形态变化。

1.2.3 血清指标检测 血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平采用全自动生化分析仪(美国德灵Dimension RXL Max)测定。按照ELISA试剂盒说明书检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.4 肾组织中MDA水平和SOD活性检测 称1 g肾组织，放入玻璃匀浆器中，加冷生理盐水在冰上研磨成10%的组织匀浆，3 000 r/min低温离心10 min后取上清液，分别按照试剂盒操作步骤对MDA水平和SOD活性进行检测。蛋白浓度用BCA蛋白水平测定试剂盒检测。

2 结 果

2.1 肾组织形态学变化 见图1。HE染色可见假手术组肾小球和肾小管结构正常，发现IR组肾小管排列紊乱，管腔扩张，部分刷状缘消失；肾小管上皮细胞肿胀，坏死；管腔内可见管型；肾间质炎症细胞浸润。长春西汀干预后肾组织病理损伤减轻，其中高剂量干预组损伤改善更显着，可见肾小管结构完整，排列整齐，管腔内管型减少，炎症细胞少见。

注：A为假手术组；B为IR组；C为长春西汀低剂量干预组；D为长春西汀高剂量干预组。

2.2 4组肾功能指标变化 见表1。与假手术组相比，IR组SCr和BUN水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；长春西汀干预组SCr和BUN与IR组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；长春西汀高、低剂量干预组SCr和BUN差异也有统计学意义(P<0.05)。

2.3 血清中TNF-α、IL-1β、IL-6结果比较 见表2。与假手术组相比，小鼠肾IR可引起细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。用长春西汀预处理后，与IR组相比，TNF-α、IL-1β 和IL-6表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量组降低更显着，与低剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 肾组织中MDA水平和SOD活性变化 见表3。与假手术组比较，IR组肾组织中MDA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，SOD活性明显降低，差异也有统计学意义(P<0.05)；长春西汀低剂量干预组与IR组相比，MDA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，SOD活性虽有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量干预组与IR组相比，MDA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，SOD活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 4组SCr和BUN结果比较

注：与假手术组比较，#P<0.05；与IR组比较，*P<0.05；与长春西汀低剂量组比较，△P<0.05。

表2 4组TNF-α、IL-1β、IL-6结果比较

注：与假手术组比较，#P<0.05；与IR组比较，*P<0.05；与长春西汀低剂量组比较，△P<0.05。

表3 4组MDA和SOD结果比较

注：与假手术组比较，#P<0.05；与IR组比较，*P<0.05；与长春西汀低剂量组比较，△P<0.05。

3 讨 论

本研究采用夹闭双侧肾蒂造成肾缺血45 min再恢复血供的方法建立小鼠肾IR损伤模型[4]。术后24 h，IR组小鼠SCr和BUN升高，肾组织病理损伤明显，提示肾脏IR模型制备成功。给予长春西汀干预后，SCr和BUN水平降低，肾组织病理损伤减轻，由此提示长春西汀干预处理可以改善肾IR损伤程度。

肾IR损伤中有众多的炎症介质和免疫因子参与，TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高已经成为肾IR炎症的重要标志[5]。TNF-α是活化单核细胞产生的多活性细胞因子，其能刺激单核巨噬细胞合成和分泌IL-1β和IL-6等炎症因子[6]。本研究中IR组TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高，证明有炎症参与了组织损伤。长春西汀干预组相对IR组TNF-α、IL-1β和IL-6表达降低，提示长春西汀可以通过抑制炎症改善肾IR损伤。研究表明，长春西汀作为磷酸二酯酶抑制剂，能够抑制炎症相关因子，如核转录因子NF-κB和TNF-α的表达，从而降低IL-1β、IL-6和IL-8等炎症因子的表达，起到保护组织的作用[2,7]。

氧自由基的生成被认为是IR损伤中最重要的发病机制之一[8]。大量氧自由基能够攻击细胞膜的脂质和蛋白质，导致脂质过氧化，破坏组织的结构和功能。MDA是脂质过氧化的产物之一，能够直接反映组织损伤程度[9]。SOD是一种重要的抗氧化酶，能够保护细胞免受氧自由基的攻击。本研究中与假手术组相比，小鼠IR后肾脏中MDA水平升高，SOD活性降低，表明肾IR后氧自由基产生增多，损伤了生儿缺血缺氧性脑病预后的影响[J].临床儿科杂志，2006，24(3)：188-190.

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Protective effect of vinpocetine on mice renal ischemia-reperfusion injury*

KONGXiao-jun1,WANGXiao-mei1,GAOXin2,LIJian-yuan3△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.SchoolofLifeScience,YantaiUniversity264005；3.CentralLaboratory,YantaiYuhuangdingHospital,Yantai,Shandong264004,China)

Objective To investigate the protective effect and mechanism of vinpocetine in renal ischemia-reperfusion injury.Methods Forty-eight healthy male mice were randomly divided into the sham operation group,ischemia-reperfusion (IR) group,low dose and high dose(10 mg/kg and 20 mg/kg) vinpocetine pretreatment groups.The renal ischemia-reperfusion injury models were established by clamping bilateral renal pedicle for 45 min.The renal morphology changes were observed by the HE staining.The Scr,BUN,TNF-α,IL-1β and IL-6 levels at 24 h after reperfusion were detected.The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) contentrations were determined.Results Compared with the sham operation group,the pathological changes in the IR group were tubular dilatation,loss of brush border and casts in lumen.The levels of Scr,BUN,TNF-α,IL-1β and IL-6 in the IR group were significantly increased(P<0.05).The SOD activity of kidney tissue was significantly decreased and the MDA contentration was increased,the differences were statistical significant(P<0.05);compared with the IR group,vinpocetine10 mg/kg and 20 mg/kg could improve the pathological injury of renal tissue in a dose-dependent manner,the levels of Scr,BUN,TNF-α,IL-1β,IL-6 and MDA were decreased and the SOD activity was increased,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion Vinpocetine can ameliorate the renal ischemia-reperfusion injury in mice by inhibiting inflammation and oxidative stress.

vinpocetine; renal ischemia reperfusion; inflammatory factor; oxidative stress

国家自然科学基金(31071262)。

孔晓君，女，硕士,初级检验技师，主要从事肾缺血再灌注损伤机制研究。

△通讯作者，E-mail：sdsclj@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.002

A

1672-9455(2015)09-1183-02

2014-11-29

2015-01-20)