夏 冰，朱 辉，黄正旭，刘仲明，王 捷(.广州军区广州总医院医学实验科，广州 5000；.广州禾信分析仪器有限公司，广州 50530)
促甲状腺激素释放激素的电喷雾电离-飞行时间质谱检测*
夏 冰1，朱 辉2，黄正旭2，刘仲明1，王 捷1(1.广州军区广州总医院医学实验科，广州 510010；2.广州禾信分析仪器有限公司，广州 510530)
目的 探讨质谱技术在促甲状腺激素释放激素(TRH)检测中的应用。方法 将样品用电喷雾电离源在正离子模式下电离，然后置入飞行时间质谱仪检测。先使用利血平甲醇溶液观察仪器状况，再用稀释好的TRH溶液进样。结果 TRH产生5个明显的信号峰，分别位于m/z 249.074 8、363.138 2、385.111 9、401.000 0、763.234 5，其中m/z 249.074 8为TRH的特征性碎片峰。结论 该研究建立了电喷雾电离-飞行时间质谱技术鉴定TRH的方法，其特异性高及检测速度快，为下一步研究TRH的定量质谱检测方法奠定了基础。
促甲状腺激素释放激素； 质谱技术； 电喷雾电离
促甲状腺激素释放激素(TRH)是最早被发现的促垂体激素，其相对分子质量较小，仅为1个三肽(pGlu-His-Pro-NH2)，主要产生于下丘脑[1]。近年来研究发现，TRH并不仅表达于脑内，其在肌体内广泛分布，发挥多种多样的生理功能。TRH除了调控促甲状腺激素(TSH)从垂体前叶释放，还具有抗抑郁、抗癫痫、神经修复、升血压，抗休克、降血糖、免疫调节、促进头发生长和变黑等作用[2-4]。在已有的TRH检测方法中，电化学荧光和高压液相色谱(HPLC)法的操作十分繁琐，放射免疫法灵敏度很高但特异性较低[5]。这些方法的缺点限制了在实际工作中的应用，尤其满足不了临床检验和药学研究的需要。为此，本研究尝试建立一种利用质谱仪检测TRH的新方法，报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 (1)仪器：电喷雾电离源(广州禾信分析仪器有限公司自主研制)；大气压电离飞行时间质谱仪(广州禾信分析仪器有限公司自主研制，型号APITOF5000)；0.5 mL注射器(Hamliton)；兰格实验室用注射泵LSP01-1A；喷针(内径250 μm、外径1/16英寸)、喷雾毛细管(内径100 μm、外径190 μm)。(2)试剂：促甲状腺激素释放激素(Sigma-aldrich,P1319-50 mg)；利血平(阿拉丁试剂上海有限公司，HPLC级]；甲醇(Dikma公司，HPLC级)；纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司，屈臣氏)。
1.2 方法 首先使用1.7×10-7mol/L利血平甲醇溶液[溶剂为甲醇∶水=80∶20(V/V)]，观察仪器状况，然后取100 μL TRH水溶液(5×10-4mol/L)与2 mL溶剂[甲醇∶水=80∶20(V/V)]混匀，获得浓度为2.5×10-5mol/L的TRH溶液，上样。第1步使用电喷雾电离源将样品电离，第2步利用质谱仪进行分析。电喷雾离子化模式:正离子模式;TOF 运行模式:V 模式;分辨率:4 000～5 000;扫描范围:m/z 80～3 000;离子源电压3.5 kV；毛细管电压(Capillary):150 V;毛细管温度:150 ℃;四极杆接口电压150 Vpp;调谐溶液:利血平 (m/z 609.273)，30 pg/μL。辅气为0.5 MPa高纯氮气，进样流速为7 μL/min。质谱检测与分析软件为禾信自主研发的TDC数据采集处理软件，版本号TDC-V1.1。
2 结 果
2.1 利血平溶液(1.7×10-7mol/L)实验结果 利血平相对分子质量为608.68，质谱图上显示的数据与之相符，表明仪器状况正常，可用于后续的样品检测。见图1。
图1 利血平溶液(1.7×10-7 mol/L)实验
2.2 TRH样品的检测结果 将稀释好的TRH溶液(2.5×10-5mol/L)进样，一共产生5个明显的信号峰，分别位于m/z 249.074 8、363.138 2、385.111 9、401.000 0、763.234 5。见图2。
图2 TRH样品的检测结果
3 讨 论
1970年Guillemin小组首次报道了TRH这一参与调节垂体激素释放的物质，但后来的相关研究表明，该三肽的生理功能远不止于此，而且在某些疾病时其含量会发生变化。这些新发现要求建立一种检测TRH的特异而敏感的方法。目前已有的检测方法均存在各种缺陷，如放射免疫测定法由于仅针对免疫表位从而缺乏分子的特异性，导致定性与定量的不准确；荧光定量PCR技术则由于mRNA水平不总是反映实际的基因表达量而造成检测结果也不准确，因此有必要研发更高特异性的定性与定量手段检测TRH。
质谱技术被公认为是一种检测和分析蛋白质及小分子的重要方法。有学者研究报道，可用质谱法检测的生物活性多肽包括视紫质、C-反应蛋白、β-内啡肽等[6-8]。本研究建立了一种基于质谱的快速而敏感的TRH检测方法，本实验数据显示，m/z 249.074 8为TRH电离后产生的特异性碎片峰，相当于N端焦谷氨酸-组氨酸二肽，与Chambery等[9]用质谱方法检测的结果一致。TRH的相对分子质量为362.38，因此其分子离子峰(M+H+)理论上应在m/z 363.38。而本组实验的测定值为363.138 2，与理论值略有差异，可能是由于样品浓度过高、相应的峰过于饱和导致实验误差。m/z 385.111 9为TRH与Na+(MW=23)络合形成的峰(M+Na+)，m/z 401.000 0为TRH与K+(MW=39)络合形成的峰(M+K+)，m/z 763.234 5为2个TRH分子与1个K+络合形成的峰(2M+K+)。图谱中这些Na+、K+的掺入可能是由于原液在玻璃瓶中浸泡时间过长所导致。
综上所述，本研究方法用于检测TRH具有高度的特异性，而且操作简便，耗时少，从上样到取得结果仅需数分钟。下一步本组将研究TRH定量分析的质谱技术，最终达到检测生物体液和组织TRH含量的目标。
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Detection of thyrotropin-releasing hormone by electrospray ionization-time of flight mass spectrometry*
XIABing1,ZHUHui2,HUANGZheng-xu2,LIUZhong-ming1,WANGJie1
(1.DepartmentofMedicalResearch,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou,Guangdong510010,China;2.GuangzhouHexinAnalyticalInstrumentCompany,Guangzhou,Guangdong510530,China)
Objective To explore the application of mass spectrometry in the detection of thyrotropin-releasing hormone(TRH).Methods The sample was ionizated by electrospray source operating in positive-ion mode，and then was analyzed by a time of flight mass spectrometer.After we were sure that the equipment condition was fine by injecting reserpine first,we injected TRH to the system.Results TRH produced 5 peaks,which were at m/z 249.074 8、363.138 2、385.111 9、401和763.234 5 respectively,and the fragment at m/z 249.074 8 was a specific TRH product.Conclusion In this study we have established a method of detection of TRH by electrospray ionization-time of flight mass spectrometry,which has high sensitivity and high speed,so it has laid the foundation for our future study on quantification of TRH by mass spectrometry.
thyrotropin-releasing hormone; mass spectrometry; electrospray ionization
广东省科技计划项目(2013B021800052)。
夏冰，女，博士，副主任医师，主要从事基础医学研究。
10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.003
A
1672-9455(2015)11-1504-02
2014-12-15
2015-02-18)
