张海霞，冯若飞,，王 丹，徐 雷，谢晶莹，李向茸，马忠仁△
(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，兰州 730030；2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，兰州 730030)
·论 着·
人脑心肌炎病毒免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验的建立及初步应用
张海霞1，冯若飞1,2，王 丹2，徐 雷2，谢晶莹2，李向茸1，马忠仁1△
(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，兰州 730030；2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，兰州 730030)
目的 建立脑心肌炎病毒(EMCV) 免疫球蛋白M(IgM)捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法，用于感染EMCV血清学早期诊断。方法 用抗人IgM(μ链)单抗进行包被，辣根过氧化物酶(HRP)标记的EMCV为酶标抗原，初步建立EMCV IgM捕获ELISA；对建立的方法进行条件优化及特异性、精密性、稳定性等验证。结果 建立的EMCV IgM捕获ELISA检测方法抗体包被浓度为1 μg/mL，EMCV-HRP工作浓度和反应时间分别为1∶400和45 min，封闭液为10%马血清时该法检测效果可达最佳，3批试剂批内及批间变异系数均小于5%，且特异性、精密性及稳定性较好。结论 建立的EMCV IgM捕获ELISA法特异、精密且稳定，可用于人感染EMCV的早期检查，为EMCV的诊断奠定基础。
脑心肌炎病毒； 免疫球蛋白M； 酶联免疫吸附试验； 初步应用
脑心肌炎病毒(EMCV)是微RNA病毒科，心病毒属的唯一成员，根据分离来源的不同，有时也称哥伦比亚-SK(Columbia-SK)、小鼠脑脊髓炎病毒(MEV)、门哥(Mengo)病毒[1-2]。1945年在美国佛罗里达州，从一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内，首次分离到EMCV，1958年在巴拿马首次证明导致猪死亡的病原体是EMCV[3-7]。随后陆续有报道，EMCV在世界上很多国家爆发和流行[8-9]。EMCV和其他部分小RNA病毒有着类似的组装结构和抗逆的理化特性，病毒粒子呈圆形状，直径为20～30 nm，无囊膜裸露的核衣壳，病毒粒子的衣壳为对称结构的二十面体，衣壳内含一单股正链RNA，3′端有poly(A)尾，5′端没有帽子结构，该衣壳在CsCl中的浮密度为1.33～1.34 g/cm3。本病毒在56 ℃ 1 h能灭活，但对氯仿、乙醚、乙醇等脂溶剂有很强的抵抗力。哺乳动物中以猪对EMCV的敏感性最强，感染后多出现致死性心肌炎和心肌周围炎等，处于妊娠期的母猪大多出现死胎、弱胎、流产、木乃伊胎等繁殖性障碍，其他的表象中，健康猪多呈隐性感染[10-13]。据有关报道，猪脑心肌炎发病高的地区，人感染EMCV也较高[14]。灵长类动物中主要以人类为主，人类被EMCV感染后，大多出现头痛、发热、精神萎靡、身体僵硬、呕吐等主要症状，有学者从患者和其他正常人群血清中检测到 EMCV抗体，并从患脑膜炎和脑炎的儿童体内分离到EMCV，说明EMCV可感染人类并可造成较为严重的损伤，这就要求在临床中务必做到早诊断、早预防[15]。然而，现有针对EMCV IgM的检测只有中和试验等一些传统方法，不仅耗时、费用高，而且结果准确度不高，难以满足现代快速、准确、成本低的诊断要求。因此，建立一种快速准确检测EMCV IgM抗体的方法在EMCV早期诊断中尤为重要。利用抗人μ链抗体捕获EMCV IgM，可以达到早期血清学检测、免疫分析、抗原抗体相互作用检测等各种试验目的，为EMCV的早期诊断和流行病学调查奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料来源 EMCV(VR-129株，ATCC)抗原由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供。
1.2 试剂 抗人IgM(μ链)单抗购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)购自华美生物工程公司；
1.3 EMCV标酶 通过改良过碘酸法，将HRP标记于灭活的EMCV，之后将标记混合物经硫酸铵盐析，NaAC-HAC中透析，柱层析(Sepharose-4FF)，收集峰1，即为酶标记抗原(EMCV-HRP)，经间接ELISA测定效价后，加入50%的丙三醇，分装置于-20 ℃冻存[16-17]。
1.4 人EMCV IgM捕获ELISA的建立及条件优化
1.4.2 阴阳性对照的确定 参考上述初步建立的EMCV IgM捕获ELISA操作步骤，筛选出EMCV IgM阳性血清，阴性血清；选取A值最高的阳性3份混合，选取A值最低阴性的3份混合，并56 ℃灭活30 min后分别用0.22 μm的膜过滤，无菌分装，置-80 ℃保存备用。
1.4.3 条件优化 (1)最佳包被浓度的确定。将抗人IgM(μ链)单抗分别稀释至8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/mL进行包被，其余步骤参照1.4.1，根据结果确定最佳的包被浓度。(2)最佳EMCV-HRP浓度的确定。EMCV-HRP的工作浓度分别为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600，其余步骤参照1.4.1，根据结果确定最佳的EMCV-HRP浓度。(3)最佳酶标抗原反应时间的确定。加入的酶标抗原反应时间分别为15、30、45、60、75 min，其余步骤参照1.4.1，根据结果确定最佳酶标抗原反应时间。(4)最佳底物显色的时间。加入底物显色时间分别为10、15、20、25、30、35 min，其余步骤参照1.4.1，根据结果确定最佳底物显色时间。(5)最佳封闭液的选择。封闭液分别选用PBST、10%马血清、10%牛血清、1%卵清蛋白、2%蛋白胨、5%脱脂奶粉，其余步骤参照1.4.1，根据结果确定最佳封闭液。
1.5 精密性试验 选择1份A450 nm/A630 nm值在1.1左右的阳性对照血清进行精密性验证。抽取同一批试剂的5块包被板，每板抽取1条，每条抽取2孔共10孔，进行批内精密性试验；抽取连续3批试剂按批内精密性试验抽样，共30孔，进行批间精密性试验，计算变异系数(CV)，分析批内和批间精密性。
1.6 特异性试验 用上述方法分别检测乙型肝炎病毒(HBV)、戊型肝炎病毒(HEV)抗体、乙型脑炎病毒(JEV) IgM抗体及阴阳性对照，其余步骤参照1.4.1，确定该方法的特异性。
1.7 稳定性试验 将上述包被板及试剂随机分成两部分，分别置4、37 ℃各保存6 d，分别检测7个弱阳性样本(A值在0.2左右样本)，其余步骤参照1.4.1，验证试剂的稳定性。
2 结 果
2.1 EMCV IgM捕获ELISA方法的最佳条件 最佳条件确定均以阳性血清A值作为P值，阴性对照A值作为N值，分别计算P/N。然后以考察条件作横坐标，P/N作纵坐标绘制折线图。
2.1.1 最佳包被浓度 随着包被浓度增加，P/N先升高后下降，在0.5～1 μg达到峰值，一般选择最优条件为峰值左右，且稀释度不宜过大，所以最佳的抗人IgM包被浓度为1 μg/mL。见图1。
图1 抗人IgM包被浓度的确定结果(P/N)
2.1.2 最佳EMCV-HRP工作浓度 每个IgM阳性血清稀释度条件下，P/N值都随着EMCV-HRP稀释的增加而先升高后下降，而在1∶400浓度时的P/N均最大，所以EMCV-HRP的最佳工作浓度为1∶400。见图2。
图2 酶标EMCV工作浓度(P/N)
2.1.3 最佳EMCV-HRP反应时间 随着EMCV-HRP反应时间的增加，P/N先升高后下降，而在反应时间为45 min时，P/N最高，所以EMCV-HRP的最佳反应时间为45 min。见图3。
图3 酶标抗原反应时间确定结果(P/N)
2.1.4 最佳底物显色时间 随着显色液反应时间的增加，P/N先升高后下降，在显色时间为25 min时，P/N最高，所以显色液的最佳反应时间为25 min。见图4。
图4 最佳显色反应时间确定结果(P/N)
2.1.5 最佳封闭液的确定 在不同封闭液下，10%马血清封闭时，P/N最大，因此10%马血清封闭液为最适。见图5。
图5 封闭液确定(P/N)
2.2 精密性试验 3批试剂的批内及批间CV均小于5%，表明建立的方法精密性较好。见表1。
表1 方法的精密性验证
2.3 特异性试验 本方法只能检出EMCV IgM抗体，其他均为阴性，表明该法特异性较好。见图6。
图6 特异性验证
图7 热加速稳定性
2.4 稳定性试验 热加速降解实验试剂与4 ℃存放6 d的试剂相比，检测的7个弱阳性样本，存放于37 ℃的检测值略低于4 ℃，但变化相差不大，表明稳定性良好。见图7。
3 讨 论
本研究成功建立了EMCV IgM捕获ELISA方法：将抗人IgM(μ链)单抗稀释至1 μg/mL，以100微升/孔加入96孔聚苯乙烯微量滴定板，4 ℃过夜；PBST洗涤1次，并轻轻拍干，用10%马血清封闭液室温封闭过夜；甩干后，加入100微升/孔待检样本，37 ℃反应1 h；PBST洗涤5次拍干后，加入100微升/孔 1∶400的EMCV-HRP，37 ℃反应45 min，洗涤5次后拍干，加入底物显色25 min，终止，读取450和630 nm波长处样本A值。
对上述优化的EMCV IgM捕获ELISA方法进行验证，结果显示：批内及批间CV均小于5%，精密性良好；只能特异性地检出EMCV IgM抗体；包被板和试剂具有良好的热稳定性。说明该EMCV IgM捕获ELISA方法的精密性、特异性及稳定性均较好。
IgM是人的免疫球蛋白之一，在感染过程中IgM首先出现，但持续时间不长，是近期感染的标志。本研究首次成功建立的EMCV IgM捕获ELISA法，较其他ELISA而言，检测样本时不需要稀释，且不受类风湿因子的影响，有很高的特异性，不产生假阳性，其准确性较高。且较间接ELISA及双抗原夹心ELISA，该法更能准确地应用于EMCV感染早期的快速诊断，从而确定EMCV早期感染情况。总之，该法为EMCV早期感染的检测提供了新的手段，也为EMCV抗体监测、流行病学调查提供了更有效的工具。
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Establishment and preliminary application of EMCV IgM capture ELISA method*
ZHANGHai-xia1,FENGRuo-fei1,2,WANGDan2,XULei2,XIEJing-ying2,LIXiang-rong1,MAZhong-ren1△
(1.GansuEngineeringResearchCenterforAnimalCells,Lanzhou,Gansu730030,China;2.KeyBio-EngineeringandTechnologyLaboratoryofNorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou,Gansu730030,China)
Objective To establish the encephalomyocarditis virus(EMCV) immunoglobulin M(IgM) captured enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) detection method for the application in early serological diagnosis of EMCV infection.Methods Anti-human(μ chain) monoclonal antibody was used to conduct the coating and the horse radish peroxidase(HRP) labelled EMCV served as the enzyme labeled antigen,the EMCV IgM capture ELISA method was preliminarily established;The established method was performed the conditional optimization and verification of the specificity,precision and stability.Results The antibody coating concentration in the established EMCV IgM captured ELISA method was 1 μg/mL,the EMCV-HRP work concentration and reaction times were 1∶400 and 45 min respectively.When the blocking solution was 10% horse serum,this method achieved the best effect.The intra-assay and inter-assay coefficients of variation in 3 batches of reagents were less than 5%,and the specificity,precision and stability were better.Conclusion The established EMCV IgM capture ELISA method is specific,precise and stable,can be used for the detection of early human EMCV infection and lays the foundation for the EMCV diagnosis.
EMCV; IgM; ELISA; preliminary application
国家自然科学基金项目(31160033、31460665)；教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT13091)。
张海霞，女，助教，硕士，主要从事分子病毒学方面的研究。△
，E-mail:mazhongren@xbmu.edu.cn。
10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.001
A
1672-9455(2015)15-2139-03
2015-02-25
2015-03-15)
