李 美,杨正海,李 婕,李小宁
(皖南医学院弋矶山医院检验科,安徽芜湖 241001)
鲍曼不动杆菌(Ab)属于一种条件致病菌，有着较强的耐药性，大多数感染Ab的患者仅仅对碳青霉烯类及多黏菌素类药物治疗有效[1]。根据统计数据显示，目前该菌株的临床检出率已经超过铜绿假单胞菌，位于非发酵菌的首位，并且随着多重耐药菌株的出现，Ab的耐药能力与耐药广泛性大幅度提高，因此如何控制Ab的传播及如何快速有效地诊治感染耐多药Ab的患者，已经变成临床医学和检验医学研究人员遇到的棘手问题[2]。按照2015年全国细菌耐药监测网数据统计显示，不动杆菌属(Ab占93.4%)对亚胺培南与美罗培南的耐药已经达到62.0%与70.5%[3]。所以，分析其耐药原因及消除和防控该菌的感染是十分关键的[4]。本研究对本院Ab OXA基因，以及ISAba1对OXA-23基因表达的影响进行分析，分析Ab对碳青霉烯类抗菌药物有着较高耐药率的因素，通过迅速检测Ab的ISAba1与OXA基因型，为早期诊断耐药性的Ab、及时配合临床科学化用药治疗提供参考。
1 材料与方法
1.1材料来源 收集本院2015年5月至2016年5月临床分离的非重复Ab共90株。其中男性标本65株，女性标本25株，平均年龄均为64岁。其中痰78株，分泌物4株，血、尿和脓液各2株，引流液及脑脊液各1株。常规分离培养菌株，VITEK 2 Compact型全自动微生物鉴定仪鉴定为Ab后保存于-80 ℃。质控菌株AbATCC15151购自美国菌种中心，铜绿假单胞菌ATCC27853购自原国家卫生计生委临床检验中心。pET-28b(+)克隆载体，大肠埃希菌DH5α由安徽师范大学生命科学院朱国萍教授赠送。
1.2仪器与试剂 VITEK 2 Compact型全自动微生物鉴定仪及菌种鉴定和药敏卡(法国梅里埃公司)、比浊仪(Bio-Merieux公司)；CO2培养箱(Thermo Fisher公司)；生物安全柜(ESCO公司)；电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；超纯水仪、超低温冰箱(美国NBS公司)等。2×Prime STAR MAX，细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA Marker Ⅱ，DNA Marker Ⅲ,溴乙锭，MH琼脂，琼脂糖均购自北京天根生物科技公司；PCR引物合成，测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。本实验中所用引物，见表1。
表1 PCR扩增引物
注：*为PCR扩增blaOXA-23和ISAba1全序列所用引物；-为无数据
1.3方法
1.3.1模板DNA的制备 根据细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)说明书按照操作步骤提取DNA模板，PCR电泳检测确认，-20 ℃保存备用。
1.3.2耐药基因的检测 多重PCR检测(10 μL体系)：多重PCR检测OXA基因及插入序列1(blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58和ISAba1)。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃复性30 s、72 ℃延伸20 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。PCR扩增产物经含0.5 μg/mL溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察结果并拍照。
PCR扩增耐药基因全序列(50 μL体系)：blaOXA-23和ISAba1基因完整序列的扩增。其PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸15 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。ISAba1-blaOXA-23基因完整序列的扩增，其PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、60 ℃复性30 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。
1.3.3琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物经含0.5 μg/mL溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察结果并拍照。
1.3.4PCR产物的纯化 天根生化公司DNA产物纯化试剂盒，按说明书进行PCR产物纯化。
1.3.5PCR产物的连接 双酶切的PCR产物blaOXA-23和ISAba1和ISAba1-blaOXA-23与双酶切的pET-28(+)质粒的连接。
1.3.6PCR连接产物的转化与测序 将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态，筛选出阳性转化子。对阳性转化子进行鉴定。对PCR阳性的转化子扩大培养后送南京金斯瑞生物科技有限公司采用3730 DNA自动测序仪(Applied Biosystems公司)双向测序。测序结果经BioEdit软件拼接后在GenBank数据库在线Blast，分析blaOXA-23序列的一致性，并用BioEdit软件制作比对图。
1.3.7药敏实验 采用肉汤稀释法测定转化阳性菌株和空载质粒重组菌株对亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度(MIC)值，操作及结果解释参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)2015年标准判断。
2 结 果
2.1OXA酶基因和插入序列ISAba1检测结果 90株Ab中，耐碳青霉烯类药物的菌株有61株，所有菌株blaOXA-51均是阳性， 其中blaOXA-23阳性菌株73株，ISAba-1阳性菌株86株，未检测到blaOXA-24，blaOXA-58阳性菌株，17株未检测到blaOXA-23阳性的菌株中有11株对亚胺培南敏感，11株对亚胺培南敏感的菌株中有4株也未检测到ISAba1，见表2。部分多重PCR电泳结果，见图1。
表2 90株Ab blaOXA酶基因及ISAba1的检出率
2.2转化实验结果 挑选blaOXA-23和ISABa1阳性菌株进行全序列PCR扩增，扩增后的blaOXA-23，ISABa1，ISABa1-blaOXA-23全序列转化DH5α，重组质粒PCR鉴定结果显示blaOXA-23，ISABa1，ISABa1-blaOXA-23和PET-28b(+)载体均连接成功，PCR电泳结果，见图2。提取经双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株1ml交送南京金斯瑞有限公司采用双向测序，测序引物为pET-28b(+)通用引物。用BioEdit软件与GenBank中已报道的基因序列进行比对，都与注册号为GQ861439.1的Ab菌株100%一致。
注：M为标记物；1～2,4～8,10～11泳道为含有blaOXA-23，blaOXA-51和ISAba1的菌株检测结果；3泳道为含有blaOXA-51和ISAba1的菌株检测结果；9泳道为仅含有blaOXA-51的菌株检测结果
图1多重PCR检测4种OXA酶基因及插入序列1的扩增产物条带
注：M为标记物；1泳道为空载pET-28b(+)质粒；2泳道为含有blaOXA-23的重组质粒的检测结果；3泳道为含有ISAba1的重组质粒检测结果；4泳道为含有ISABa1-blaOXA-23的重组质粒检测结果
图2重组质粒双酶切鉴定
2.3转化菌株药敏实验 转化阳性菌株pET28b(+)-blaOXA-23、pET28b(+)-ISAba1、pET28b(+)-ISAba1-blaOXA-23和空载的pET28b(+)对亚胺培南MIC值分别为4.00、1.00、64.00、和0.12 μg/mL。对美罗培南MIC值分别为4.00、0.50、16.00和0.03 μg/mL。
3 讨 论
现如今医疗水平不断在迅猛发展，但是全球范围内都有着同样一个趋势，即Ab的临床感染和耐药现状日益严重，尤其是对耐碳青霉烯类的Ab治疗方法十分有限，应当引起医务人员的高度重视[6]。因此研究Ab流行菌株的耐药基因特征对于指导合适的抗菌药物针对性的治疗就显得极其重要[7]。
众所周知，D类blaOXA是Ab最常见的碳青霉烯酶。除了固有的blaOXA-51酶，还包括blaOXA-23，blaOXA-24，blaOXA-58类型的碳青霉烯水解酶[8]。
本实验通过检测90株Ab的OXA酶基因和ISAba1，其中耐碳青霉烯类药物的菌株有61株，发现所有的菌株均携带blaOXA-51，blaOXA-23阳性菌株73株，ISAba1阳性菌株86株，blaOXA-23和ISAba1均为阳性的菌株73株，未检测到blaOXA-24，blaOXA-58阳性菌株，17株未检测到blaOXA-23阳性的菌株中有11株对亚胺培南敏感，11株对亚胺培南敏感的菌株中有4株也未检测到ISAba1，说明本地区的OXA酶基因型主要以blaOXA-23和blaOXA-51为主，Ab对碳青霉烯类抗菌药物存在较高的耐药性与blaOXA-23基因的表达存在关系，插入ISAba1也在耐碳青霉烯的Ab中发挥着一定的作用。61株耐碳青霉烯的Ab中有55株blaOXA-23阳性(占90.16%)，与WU等[9]的研究结果相符，即在中国blaOXA-23是Ab中最常见的碳青霉烯酶基因，并且90%的亚胺培南耐药菌株存在blaOXA-23。
Ab的耐药机制非常复杂，其耐药的生化机制主要涉及产氨基糖甙类药物修饰酶、AmpC酶、碳青霉烯酶、青霉素结合蛋白的改变和主动外排泵出机制、代谢方式的改变、外膜蛋白的丢失或膜孔蛋白的缺损等[10]。为了更好地了解blaOXA-23，与ISAba1以及ISAba1-blaOXA-23对碳青霉烯类抗菌药物产生的影响,为了防止其他条件对其造成影响，本实验选取了blaOXA-23基因和ISAba1阳性菌株设计了全序列耐药基因PCR扩增。分别将blaOXA-23基因，ISAba1和带有插入序列ISAba1的blaOXA-23全序列片段转化到大肠埃希菌DH5α中，测序，其中ISAba1位于blaOXA-23基因上游33 bp处。通过MH肉汤稀释法测得转化阳性菌株pET28b(+)-blaOXA-23、pET28b(+)-ISAba1、pET28b(+)-ISAba1-blaOXA-23和空载的pET28b(+)对亚胺培南MIC值分别为4.00、1.00、64.00、和0.12 μg/mL。对美罗培南MIC值分别为4.00、0.50、16.00和0.03 μg/mL。检测结论说明，单独的blaOXA-23和ISAba1能够对对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性产生影响，不过ISAba1对blaOXA-23基因的高表达，导致Ab对碳青霉烯类抗菌药物呈现高度耐药。研究结果和VIANA等[11]的文章报道是一致的。
综上所述，应用分子生物学技术快速检测AbblaOXA-23基因和ISAba1，可以及时筛选blaOXA-23基因和ISAba1阳性的Ab，从而避免使用碳青霉烯类药物，为临床科学用药，有效减少高耐药、多重耐药细菌的产生提高理论依据。
