陈建平，朱 菁，黄 旭，梅亚宁
1.江苏省南京市六合区人民医院检验科，江苏南京 211500；2.南京医科大学附属儿童医院检验科，江苏南京 210029;3.南京医科大学第一附属医院/江苏省人民医院检验学部，江苏南京 210029
在我国，肠杆菌科细菌感染不断增加，已成为医院内感染的主要病原菌，其导致的血流感染也逐年增加。引起血流感染的肠杆菌科细菌有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌等，其中以大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌感染最常见[1-2]。这类菌株易出现耐药菌株，尤其是耐碳青霉烯酶的菌株，其导致的血流感染严重且预后较差[3]。本文收集2016年1-12月南京医科大学第一附属医院住院患者血流感染中分离无重复的亚胺培南和(或)美罗培南耐药的菌株，并对其进行碳青霉烯酶的检测，了解这些菌株相关耐药基因携带和药物敏感性，为临床治疗提供依据。现将研究结果报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 采用WHONET5.6软件，收集2016年1-12月南京医科大学第一附属医院住院患者血流感染共分离到的16株耐碳青霉烯酶菌。其中4株为大肠埃希菌，12株为肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。收集研究菌株对应患者的基本资料，包括年龄、科室、临床诊断、抗菌药物使用时间、入院到分离耐碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(CRE)时间、侵入性操作、治疗药物、转归。研究菌株编号1-16，分别对应菌株保存编号X020E6、X008C6﹑X011A9﹑X008F5﹑X016D4、X009J5、X009H5、X010F7、X015C8、X010E2、X010F1、X009A5、X015B9、X021C4、X021E4、X017G1。
1.2仪器与试剂 美罗培南、亚胺培南、氨曲南等为中国药品生物制品检定所产品，替加环素E-test条、药敏纸片、MH琼脂、MH肉汤为英国Oxoid公司产品，GNI细菌检定卡和VITEK2-Compact全自动微生物鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品，PCR检测试剂盒和DNA Marker为武汉谷歌生物科技有限公司产品。
1.3方法
1.3.1CRE初筛 用Vitek2-Compact全自动细菌鉴定仪对血流感染中的CRE进行初筛。
1.3.2改良Hodge试验 参照2016年美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100-S26文件中肠杆菌科菌产碳青霉烯酶的改良Hodge试验进行[4]。
1.3.3耐药酶基因检测 耐药酶基因检测采用PCR法，引物序列和扩增产物长度见表1。实验方法参考文献[5]。
1.3.4微量肉汤稀释法 用微量肉汤稀释法检测16株菌株对美罗培南、亚胺培南、多黏菌素、替加环素、氨曲南的敏感性，判读及结果解释参照2016年美国CLSI M100-S26文件进行。替加环素采用美国食品药品管理局(FDA)推荐的解释标准进行判读，最低抑菌浓度(MIC)≤2.0 mg/L为敏感，4.0 mg/L为中介，MIC≥8.0 mg/L为耐药。
2 结 果
2.1患者高危因素 16株研究菌株患者年龄大于60岁的占 87.50%(14/16),重症监护病房(ICU)患者占43.75%(7/16)，长期使用抗菌药物患者占68.75%(11/16)，长期住院患者占56.25%(9/16),有侵入性操作治疗患者占68.75%(11/16)。见表2。
表1 引物序列和产物
2.2改良Hodge试验结果 16株菌株进行改良Hodge试验，12株肺炎克雷伯菌改良Hodge试验阳性，4株大肠埃希菌中有2株改良Hodge试验为阳性，2株为阴性。
2.3耐药基因检测结果 耐药基因的检测结果见图1。16株CRE菌株的耐药基因均为肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC-2)基因。
注：M为DNA Marker;泳道1-16为目的基因。
图1 KPC-2基因扩增产物电泳图
注：-表示未使用抗菌药物。
2.4微量肉汤稀释法结果 用微量肉汤稀释法检测16株CRE对抗菌药物的敏感性，结果显示，16株菌株对美罗培南、亚胺培南、氨曲南耐药，对多黏菌素，替加环素敏感。见表3。
表3 16株菌株抗菌药物MIC值(mg/L)
3 讨 论
肠杆菌科细菌是社区和医院获得性感染中最常见的病原菌，可引起下呼吸道、消化道、泌尿道、血液、手术切口等多种部位感染。有研究报道，在院内血流感染中前3位的病原菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌[6]。目前，KPC-2基因型酶在我国的浙江、上海、江苏、湖南、北京、山东等多省市均有报道,其中长江三角洲地区报道最多[7]。本研究中，16株可疑产碳青霉烯类菌均含KPC-2基因，表明KPC-2是南京医科大学第一附属医院血流感染患者耐碳青霉烯酶肠杆菌科的主要基因型，与以往文献报道相似[8]。医务人员应对CRE菌株的传播与感染提高警惕，尽早采取措施监测患者感染菌的耐药情况，加强对此类患者的管理，减少其与其他患者接触的机会，切断感染途径。
耐碳青霉烯酶肠杆菌科的临床治疗一直是个难题，CRE几乎对所有β-内酰胺抗菌药物耐药，同时携带有其他耐药机制，对氨基糖苷、喹诺酮类也耐药，对多黏菌素和替加环素具有较高的体外敏感性[7]，这与本研究中药敏结果一致。我国广泛耐药革兰阴性菌感染诊治专家共识建议使用以多黏菌素和(或)替加环素为基础的联合用药方案治疗CRE细菌感染[9]。本研究中，有替加环素联合亚胺培南治疗，也有亚胺培南单独治疗，还有美罗培南联合左氧氟沙星治疗，临床均显示预后良好。
CRE引起的感染对患者威胁越来越大，目前缺乏确认有效的治疗药物，所以医院内感染控制显得尤为重要。有研究表明，CRE的易感因素有疾病危重、入住ICU、长期使用抗菌药物、有侵入性操作等[7]。本研究中的CRE病例7株分布在ICU，概率为43.75%，其他病例也主要分布在外科，这与以往文献报道一致[10]。面对CRE的威胁，医疗机构应了解患者感染CRE的危险因素，采取相应的干预措施，包括手卫生、接触隔离、医务人员培训、最低限度使用侵入性操作、检出CRE时实验室及时通知医护人员、促进抗菌药物管理、保持环境卫生等[11]。
CRE的血流感染给患者治疗带来了极大的困难，同时也给医院内感染防控提出了挑战。CRE的处理要从整体、全局出发，注重抗菌药物合理使用、病原菌检测、耐药菌监测、患者管理等[12]。因此，加强CRE的监测，严格执行抗菌药物合理使用的管理规定，同时加强医院内感染预防与控制，避
免CRE在院内传播和不断演变。
