蔡 凤
上海市杨浦区控江医院检验科，上海 200093
A组轮状病毒(RV)是造成小儿腹泻的主要病原体之一，主要通过感染小肠上皮细胞，引起细胞损伤，造成腹泻[1]。相关资料显示，A组RV感染者多为6～24个月婴幼儿，其发生率逐年升高，感染发生后常伴有低热、呕吐及水状腹泻等症状，严重时可引起大量酮体产生，致使患儿出现不同程度的脱水酸中毒现象，增加病毒性心肌炎发生风险，威胁患儿生命健康[2-3]。故加强对A组RV感染的监测及防控较为重要。但目前，临床关于腹泻婴幼儿A组RV感染的研究集中在其临床特点及治疗等方面，而关于腹泻婴幼儿A组RV感染的状况及分子流行病学特点研究报道较少且结论不一[4-5]。基于此，本研究收集432例腹泻婴幼儿的临床资料，分析A组RV感染特点及基因分型，以期为腹泻婴幼儿A组RV的监测、临床防控提供参考。现报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 回顾性分析2020年9月至2021年10月的432例腹泻患儿的临床资料。纳入标准：(1)符合《中国儿童急性感染性腹泻病临床实践指南》[6]诊断标准；(2)年龄0～5岁婴幼儿；(3)大便性状呈水样或蛋花汤样且无血便及脓血便；(4)腹泻病程<2周。排除标准：(1)严重心、肝、肾等功能障碍；(2)血流动力学不稳定；(3)有先天性呼吸道畸形、先天性心脏病等先天畸形；(4)食物过敏史、上消化道疾病家族史、寄生虫感染等。纳入患儿中，男241例，女191例；年龄为0～6个月、>6～12个月、>12～24个月、>24～36个月、>36个月者分别为52、89、92、84、115例；大便性状为蛋花汤样156例，黏液稀便128例，水样便148例。
1.2方法
1.2.1乳胶法 采用乳胶法检测腹泻患儿A组RV感染情况，A组RV试剂盒购自杭州艾博生物医药有限公司，操作均严格按试剂盒说明书操作。取约50 mg粪便标本，加入缓冲液中充分摇匀，取80 μL样本上清液滴入加样处，室温下放置，10～20 min内判读结果。
1.2.2反转录聚合酶链反应(RT-PCR) (1)核酸提取：采用NP-968C全自动核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)提取RNA，提取后置于-70 ℃下保存备测。(2)G/P基因测序：采用一步法对A组RV VP7基因及VP4基因进行扩增(试剂盒购自上海博湖生物科技有限公司)。VP7上游引物：5′-ATGTATGGTATTGAATATACCAC-3′；下游引物：5′-AACTTGCCACCATTTTTTCC-3′。VP4上游引物：5′-TATGCTCCAGTNAATTGG-3′；下游引物：5′-ATTGCATTTCTTTCCATAATG-3′。扩增步骤：50 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共5个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，共35个循环。扩增产物经上海捷瑞生物工程有限公司进行测定，测定结果根据美国国立生物计数信息中心(NCBI)序列比对检索工具进行对比，确定基因分型。
1.3统计学处理 采用统计软件SPSS22.0进行数据处理及统计分析。计数资料采用频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Logistic回归分析腹泻患儿A组RV阳性的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1腹泻患儿A组RV感染情况及分布分析 432例腹泻患儿经检测显示，A组RV阳性者108例(25.00%)，不同性别的腹泻患儿A组RV阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)，而不同年龄、患病月份及大便性状的腹泻患儿A组RV阳性检出率差异均有统计学意义(P<0.05)。其中年龄为>6～12个月、>12～24个月的腹泻患儿，患病月份为10-12月、1-3月的腹泻患儿及大便性状为蛋花汤样的患儿A组RV阳性检出率均较高。见表1。
表1 腹泻患儿A组RV感染情况及分布分析[n(%)]
2.2腹泻患儿A组RV感染多因素分析 以A组RV阳性为因变量(赋值：阳性=0，阴性=1)，以年龄0～6个月(是=0，非=1)、年龄>6～12个月(是=0，非=1)、年龄>12～24个月(是=0，非=1)、年龄>24～36个月(是=0，非=1)、年龄>36个月(是=0，非=1)、患病月份1-3月(是=0，非=1)、患病月份4-6月(是=0，非=1)、患病月份7-9月(是=0，非=1)、患病月份10-12月(是=0，非=1)、大便性状蛋花汤样(是=0，非=1)、大便性状黏液稀便(是=0，非=1)、大便性状水样便(是=0，非=1)为自变量，纳入Logistic回归分析。多因素Logistic回归分析显示，患病月份1-3月、大便性状蛋花汤样为腹泻患儿A组RV阳性的危险因素(OR=2.341、4.745，P<0.05)，而年龄为>24～36个月、年龄为>36个月、患病月份4-6月、患病月份7-9月为腹泻患儿A组RV阳性的保护因素(OR=0.154、0.096、0.405、0.432，P<0.05)。见表2。
表2 腹泻患儿A组RV感染多因素分析
2.2A组RV感染腹泻患儿G/P基因分型结果 108份A组RV阳性标本，经RT-PCR扩增，检出G型基因情况如下：G3型56株(51.85%)、G1型32株(29.63%)、G2及G9型均2株(1.85%)、G型混合感染8株(7.41%)、未确定型8株(7.41%)；检出P型基因情况如下：P[8]型89株(82.41%)、P[4]型8株(7.41%)、P[8]P[4]混合型3株(2.78%)、未确定型8株(7.41%)。另G、P组合型检出最多的为G3P[8]型49株(45.37%)，其次为G1P[8]型30株(27.78%)。见表3。
表3 A组RV感染腹泻患儿G/P基因分型结果[n(%)]
续表3 A组RV感染腹泻患儿G/P基因分型结果[n(%)]
3 讨 论
A组RV感染多见于5～24个月婴幼儿，发生后常伴有低热、呕吐、腹泻等症状出现，严重时会造成致命性胃肠炎、脱水及电解质平衡失调，对婴幼儿的生命健康造成严重威胁[7-9]。目前，临床关于A组RV感染导致腹泻的致病机制尚无明确定论。有研究者指出，A组RV对细胞表面受体具有识别作用，其不仅可感染小肠上皮细胞，而且可合成病毒蛋白，降低上皮细胞对水分及盐的吸收，从而造成婴幼儿机体内碳水化合物吸收障碍，引发渗透性腹泻[10-11]。国外研究显示，5岁以下住院腹泻患儿A组RV阳性检出率高达25%～47%[11]，而国内数据显示，腹泻患儿中A组RV阳性检出率约为26%[12-13]。本研究中，432例腹泻患儿共检出A组RV阳性者108例，阳性检出率为25.00%。该结果与国内报道的数据相近，但与国外报道的具有一定差异，提示急性腹泻患儿A组RV阳性检出率可能受地区、生活方式、收集季节等的影响。
A组RV为引起儿童腹泻的常见病原体，其感染可发于各个年龄段，但主要以5岁以下婴幼儿为主。有研究报道，与男性相比，女性感染A组RV的风险更高，但亦有研究者指出不同性别腹泻婴幼儿A组RV感染的风险无明显差异[14]。本研究中，不同性别腹泻患儿A组RV阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)，与上述研究结果具有一致性。而本研究中，不同年龄腹泻患儿A组RV阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05)，其中以年龄为>6～12个月、>12～24个月腹泻患儿A组RV阳性检出率较高，且年龄为>24～36个月、>36个月为腹泻患儿A组RV阳性的保护因素，该结果与佘文等[15]研究结果具有一致性。其原因可能与腹泻患儿免疫功能有关，年龄>6～24个月患儿自体免疫尚未完全成熟，对于各种病原体感染的特异性IgM抗体产生尚不足，免疫功能差；且该年龄段婴幼儿在进行人工喂养时，肠道局部分泌型IgA减少，因此感染病原体风险更高。本研究结果显示，年龄0～6个月、>24～36个月及>36个月的婴幼儿A组RV阳性检出率较低。其原因可能为年龄<6个月婴儿多为母乳喂养，乳汁中含有大量的分泌型IgA，其可保护肠道黏膜，使婴儿获得被动免疫；而年龄>24个月的婴幼儿自主免疫功能逐渐成熟，抵抗病原体风险能力增强。以上结果均提示提高婴幼儿的免疫力对A组RV感染的预防具有重要作用。本研究结果显示，在1-3月和10-12月(冬、春季节)A组RV阳性检出率较高，而在4-6月和7-9月(夏、秋季节)较低，且患病月份1-3月为腹泻患儿A组RV阳性的危险因素，患病月份4-6月、7-9月为腹泻患儿A组RV阳性的保护因素。该结果与国内一些研究者的结果相符[16-17]。目前临床关于A组RV感染致腹泻的季节性发病的原因尚未完全明确，可能与地区间的温度及湿度等有关，但临床可针对性地在高发季节做好A组RV的预防宣传及疫苗接种工作，以减少A组RV感染的发生。此外，本研究中大便性状为蛋花汤样的腹泻患儿其A组RV阳性检出率较高，其原因可能与致病肠毒素有关。
VP4及VP7均为病毒的外衣壳蛋白，其均可产生诱导保护性免疫应答特异性中和抗体。目前有研究指出，A组RV根据VP7核酸可分为27种G基因分型，而以VP4差异性可分为35种P基因分型，且P基因及G基因二者间可自由组合，形成A组RV复杂、多变的分子流行特征[18]。既往研究指出，A组RV中G基因以G1型为主，其次为G3、G2、G4型及G9型，而P基因以P[8]型及P[4]型为主[19]。本研究中，108份A组RV阳性标本，经RT-PCR扩增，检出的G基因以G3及G1型为主，共占81.48%；而P基因以P[8]型(82.41%)和P[4]型(7.41%)为主。另有临床研究指出，A组RV最常见的基因组合类型依次为G3P[8]型、G1P[8]型、G2P[4]型、G4P[8]型等，且占比达全部A组RV的90%以上[20]。而本研究中，G、P组合型以G3P[8]型最高，为45.37%，其次为G1P[8]型，占27.78%。该结果与刘爱玲等[21]报道的结果相符。但本研究中G、P型基因未确定型基因均为7.41%，提示A组RV的基因分型较为复杂。
综上所述，腹泻婴幼儿中A组RV为常见病原体之一，其中年龄为>6～12个月、>12～24个月的腹泻患儿，患病月份为10-12月、1-3月的腹泻患儿及大便性状为蛋花汤样的患儿A组RV阳性检出率均较高，且基因分型以G3P[8]及G1P[8]型为主，临床可根据A组RV感染的发病特征、时间等，针对性地进行预防及治疗。
