数字PCR在肿瘤无创诊疗中的应用进展*

林金端，刘红伟，冯子人，张慧贤 综述，尹卫国 审校

广州医科大学附属第六医院分子诊断中心，广东清远 511500

1999年，VOGELSTEIN创造了“数字PCR”一词，文章正式报道于美国科学院院报，并表明该技术可用于发现罕见的癌症突变[1]。数字PCR(dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，通过将一个样本分配到几十至几十万个反应单元，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，并收集荧光信号进行统计学分析。相较于传统PCR， dPCR的优势主要在于：(1)绝对定量，该技术结果判定不依赖于扩增曲线的循环阈值(Ct)，不受扩增效率的影响，具有很好的准确度和重现性。(2)样品需求量低，在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。(3)高灵敏度，dPCR本质上是将一个传统的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，在这些反应中可以精确地检测到很小的目的片段的差异、单拷贝甚至是低浓度混杂样品，且能避免非同源异质双链的形成。(4)高耐受性，由于目的序列被分配到多个微滴中，显着降低了体系间的影响及背景序列和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。因此 dPCR适用于不能依靠Ct值很好分辨的应用领域，如拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。在丰度低、样本珍贵、背景复杂的肿瘤样本检测中具有良好的应用前景。

尽管近年来肿瘤诊疗已取得了许多进展，但肿瘤仍然是全世界死亡的主要原因之一。基因分子分型检测促进肿瘤个体化治疗，显着改善了治疗效果。目前分子分型主要依赖于手术或活检组织进行PCR、免疫组织化学 (IHC) 和荧光原位杂交检测 (FISH)等方法。然而，对于早期或部分晚期肿瘤患者，难以获得足够组织样本进行检测或因各种原因无法实施活检，此时进行血液检测具有重要意义。在肿瘤晚期，凋亡和坏死的肿瘤细胞进入血液时会释放产生外周血游离 DNA(cfDNA)，cfDNA 在血浆中水平较低，片段很短，因此，使用血浆样本进行突变基因检测时如何提高检测方法灵敏度至关重要。当前灵敏度较高的检测方法主要包括突变扩增系统PCR(ARMS-PCR)、dPCR和二代测序(NGS)等。

dPCR作为第三代PCR技术，与ARMS-PCR和NGS比较，具有灵敏度高、操作流程简单、受背景信号干扰小等优点。近年来，dPCR技术在肿瘤无创诊疗领域已开始展现出独特的优势。本文将通过分析dPCR在常见肿瘤中的应用情况探索dPCR液体活检技术在大多数肿瘤诊疗中的实际临床应用效果。

1 dPCR技术与非小细胞肺癌(NSCLC)的无创诊疗

NSCLC是最常见的肺癌类型，占所有肺癌的80%～85%。目前可用于指导临床靶向药物选择的驱动基因包括表皮生长因子(EGFR)、V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)、人表皮生长因子受体 2 (HER2)、克氏大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)和间质表皮转化因子，以及间变性淋巴瘤激酶(ALK)、v-ros UR2 肉瘤病毒癌基因同源物1、原癌基因酪氨酸蛋白激酶受体和神经营养受体酪氨酸激酶1/2重排等。

1.1dPCR技术在EGFR突变NSCLC患者无创诊疗中的应用 EGFR是NSCLC中最常见的突变基因，占10%～35%。其突变类型以21号外显子L858R 和 L861Q 及19号外显子缺失最为常见，约占所有EGFR突变的85%。EGFR突变患者对酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 敏感。多重 dPCR进行血浆EGFR突变检测可显着提高其检出率，使更多患者有机会使用TKI，改善预后[2]。近期LEE等[3]基于75例早期和晚期NSCLC患者的86份血浆样本进行血浆与组织EGFR突变的检测，并将检出率进行比较，利用dPCR检测血浆EGFR突变，其检出率接近组织EGFR突变率(43.2%vs.52.3%)。

除用于驱动基因检测外，dPCR在NSCLC诊疗中的另一个重要应用方向是耐药监测。通过 dPCR 检测T790M突变已经成为EGFR突变NSCLC患者使用TKI药物后耐药监测的重要手段。SPENCE等[4]利用 dPCR技术检测343例NSCLC 患者血浆中的EGFR突变，发现24% 的患者中存在EGFR T790M突变，血浆EGFR T790M突变可有效预测奥希替尼疗效，避免患者接受侵入性组织活检。LI等[5]通过回顾性分析dPCR技术检测奥希替尼二线治疗后部分反应、疾病稳定和疾病进展期的患者血浆cfDNA中的T790M突变频率，发现奥希替尼二线治疗部分反应、疾病稳定患者血浆中T790M突变水平高于疾病进展期的患者，且血浆中T790M突变水平与患者无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)相关，但BUDER等[6]却提出NSCLC患者血浆中T790M水平与患者预后未存在明显关系。因此，目前仍需更多的研究和标准来评估dPCR技术用于血浆T790M 突变的定量是否可用于预测患者TKI治疗反应。

除T790M突变外，EGFR基因的C797S突变也是NSCLC患者奥希替尼耐药的主要原因。有20%～40%的奥希替尼耐药是由C797S 突变引起的，通过dPCR，纵向评估治疗前后血浆 EGFR T790M和 C797S 水平，显示血浆 cfDNA不同EGFR突变类型可作为评价奥希替尼治疗期间疾病进展的预后因素，这可能有助于临床决策的制订[7]。目前，dPCR 技术还用于检测晚期 NSCLC 患者中EGFR基因不太常见的突变，例如 G719S 和 L851Q[8]。此外dPCR检测EGFR突变已开始在支气管冲洗液、细针抽吸上清液、痰液和尿液等其他体液样本中进行探索。有研究表明，对于发生中枢神经系统转移的肺癌患者，也可通过检测脑脊液中的EGFR突变来评估患者预后，其预测效果优于血浆样本[9]。

1.2dPCR技术在KRAS突变NSCLC患者无创诊疗中的应用 KRAS是一种致癌驱动基因，25%～30%的NSCLC患者中存在KRAS突变[10]。尽管针对其突变的多种靶向药物对患者临床结果的影响已得到证实，但目前只有索托拉西布获得美国食品和药物管理局批准用于KRAS G12C NSCLC 患者[11]。目前已有多重dPCR技术可用于检测KRAS基因最常见的 G12/G13突变的，实现对血浆 cfDNA 进行灵敏、快速、准确的基因分型，其检出限至少可达0.2%，帮助临床医生快速判断患者是否适合使用索托拉西布[11-12]。另外，dPCR技术也用于NSCLC KRAS突变患者预后判断，目前已观察到NSCLC患者血浆KRAS突变水平随着疾病进展而增加，Ⅰ期8%，Ⅱ期30%，Ⅲ期71%，Ⅳ期73%[12]。此外，一项基于dPCR技术的研究已发现血浆 ctDNA KRAS突变水平与NSCLC患者的生存时间、化疗疗效等相关[10]。

1.3dPCR技术在ALK基因重排NSCLC患者无创诊疗中的应用 约5%的NSCLC患者存在ALK基因重排，其中以与棘皮动物微管相关蛋白样4(EMLA4)发生融合为多见，重排的ALK基因常导致持续信号激活，从而诱导细胞增殖。出现ALK-EMLA4重排的患者对克唑替尼、色瑞替尼等ALK-TKI敏感[13]，因此，高灵敏的检测技术可使更多患者获得靶向治疗机会。目前，FISH 或 IHC是ALK基因重排检测的“金标准”，但其灵敏度较低，检出限约为15%[14]。作为一种高灵敏度技术，dPCR 检测已被设计用于检测石蜡样品中的ALK-EMLA4基因易位，其检出限达0.25%[14]。

在耐药监测方面，约有20% ALK基因重排患者在接受第1代 ALK-TKI 克唑替尼治疗后，由于激酶结构域的突变而产生耐药性。因此，如何快速、高通量检测ALK突变并及时更改用药，对提高患者预后具有重要作用。目前已报道超过10个突变与第1代ALK-TKI 耐药相关，包括G1202R、F1174C/L、L1196M、G1269A、C1156Y、1151Tins、L1152R、S1206Y、I1171T、D1203N和V1180L等。已有多重dPCR用于检测多种ALK突变，在一个由7例ALK阳性NSCLC患者组成的小型队列中，多重dPCR成功地监测了疾病过程中不同的ALK耐药突变状态[15]。由于该队列入组人数较少，仍需更多的数据和研究来进一步评估dPCR检测ALK继发性突变的临床意义及其对NSCLC患者预后的影响。即便如此，该队列利用dPCR方法快速而灵敏的技术特点，通过微创的方法监测ALK耐药性突变，为临床制订用药决策提供新思路。

2 dPCR技术与乳腺癌(BC)的无创诊疗

BC是女性头号杀手，其发病率最近已超过肺癌，位居癌症之首。临床实践中，BC根据组织学和5种分子特征分为3种亚型：激素受体 (HR) 阳性 BC， HER2阳性BC，不表达HR和HER2的BC(三阴性乳腺癌) 。这些标志物可用于预测BC患者对内分泌治疗药物和免疫治疗药物的反应。其他靶点包括PIK3CA、雄激素受体、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1、雌激素受体1(ESR1)和程序性死亡受体配体1等也是目前新药研发关注的靶点。dPCR技术已开始用于BC患者的无创诊疗过程。研究表明dPCR 等比 Sanger 测序更灵敏的技术证实了早期 BC 患者手术前后可在患者血浆中检测到ctDNA，甚至比传统方法提前 11 个月预测肿瘤复发，可作为指导临床诊疗的高灵敏度的检测方法[16]。

2.1dPCR技术在BRCA基因突变BC患者无创诊疗中的应用 10%的BC患者具有遗传性，与家族病史有关。BRCA家族基因是 BC 中最常发生突变的基因，其畸变会使发生BC的风险增加70%。携带BRCA基因突变患者可能会受益于ADP-核糖聚合酶抑制剂，从而改善预后。BRCA基因改变多样，包括点突变、大基因组重排或拷贝数变异(CNV)。Sanger测序和多重连接依赖探针扩增 (MLPA) 被认为是最可靠的方法[17]。有研究表明， dPCR 在检测BRCA1基因组重排方面与MLPA具有良好的一致性[18]，但其成本约为MPLA的1/6。另外，MLPA检测每个基因外显子至少需要一个单独的反应，操作烦琐，目前已经开发出一种基于多通道的更具成本效益的多重dPCR，涵盖所有编码和非编码外显子，以及2个参考基因(RPP30和ALB)，可克服MLPA这个缺点[17]。

尽管dPCR可用于对液体活检中的BRCA基因分型，但目前仍处于起步阶段，仍需要更多的队列研究数据，进一步优化和标准化，以阐明其临床应用和意义。

2.2dPCR技术在PIK3CA突变BC患者无创诊疗中的应用 激素疗法极大地改善了HR阳性转移性BC(mBC)患者预后。然而，PIK3CA 9号外显子 E545K 和 E542K，以及20号外显子H1047R 和 H1047L 突变常导致激素疗法耐药。采用dPCR技术检测血浆 ctDNA 中这些生物标志物可用于预测 BC 疗效。已有大量的临床试验如PALOMA-3、MIRHO 和 BOLERO-2，采用dPCR技术用于分析BC患者血浆PIK3CA 突变与临床疗效的关系。尽管 PALOMA-3 和 MIRHO 试验未发现PIK3CA基线水平与PFS之间存在关联，但该研究发现了血浆PIK3CA突变患者接受氟维司群联合治疗可延长其PFS[18]。相比之下， BOLERO-2 试验发现，PIK3CA突变对其不能从哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂依维莫司二线治疗中获益，不能作为该药的疗效预测指标[19]。可见，应用dPCR技术早期鉴定 mBC 患者血浆PIK3CA突变状态，可用于更好地指导临床治疗，避免患者重复接受组织活检的痛苦。

2.3dPCR技术在ESR1突变BC患者无创诊疗中的应用 在雌激素受体阳性mBC患者中，有30%～40%患者发生ESR1突变[20]。研究表明，多数接受一线芳香化酶抑制剂(AI)治疗的mBC患者在内分泌治疗期间会获得ESR1突变，导致耐药[21]。通过dPCR，一些研究人员分析了外周血中的ESR1突变状态，结果发现与仅接受辅助AI治疗的患者相比，已接受一线AI治疗患者的突变发生率显着增加。进一步的分析表明ESR1基因Y537S和D538G突变与较短的OS相关。通过dPCR技术连续监测BC患者治疗过程中ESR1 Y537S、Y537N、Y537C和D538G位点突变水平，结果显示AI治疗可导致血浆ESR1突变水平波动，治疗后ESR1突变水平的增加是导致预后不良的原因[22]。目前采用dPCR技术能在2.5%～7.0%的原发性BC中检测到ESR1突变[23]。此外，有研究显示，血浆ESR1突变检出率甚至高于组织检出率[24]。

2.4应用dPCR技术检测血浆HER2水平在BC患者无创诊疗中的应用 在20%～30%的侵袭性BC患者中存在HER2扩增。HER2过表达导致肿瘤细胞增殖、侵袭和随后的不良预后。目前，曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗可改善HER2(+)的早期BC和mBC患者的PFS和OS[25]。目前评估HER2扩增的“金标准”是组织IHC或FISH。尽管对液体活检中的HER2扩增检测知之甚少，但已有团队通过优化dPCR检测技术，用于检测血浆中的HER2 CNV。为了确保检测结果的准确性，该团队使用EFTUD2基因作为内参，设计了HER2 dPCR检测方案，该技术对76例BC患者的检测过程中，发现以肿瘤活检结果为标准，该方法的检测灵敏度达100%，特异度达98%[26]。尽管该方法主要是为检测血浆衍生的cfDNA而开发的，但它也可以适用于甲醛固定石蜡包埋(FFPE)或新鲜冷冻组织样本。这些研究提示HER2扩增的微创测试将是一个临床转机。此外，可以进一步优化这种方法用于检测其他扩增基因。

3 dPCR技术与结直肠癌(CRC)的无创诊疗

众所周知，CRC是由参与细胞复制、增殖和侵袭性密切相关调节途径的关键基因，如腺瘤性大肠息肉、KRAS、BRAF、PIK3CA和SMAD4集中的几个突变的积累引发的。研究发现CRC组织可释放大量DNA到血液中，dPCR技术检测血浆cfDNA在肿瘤诊断、耐药监测和预后判断等患者全程管理方面有良好的应用前景[27]。

3.1dPCR技术与血浆KRAS 和 BRAF检测及其临床意义 研究表明，5%～80% CRC患者中可发现EGFR信号过度激活[28]。过去十余年，大多数疗法主要是针对MAPK 通路的激活或异常信号传导。然而，KRAS或BRAF突变会导致抗EGFR单克隆抗体治疗失败。一项基于Bio-Rad dPCR、BioCartis Idylla、Roche COBAS z480 和 Sysmex BEAMing 4个检测平台用于检测血浆 ctDNA KRAS突变的检测效能的比对研究表明，在4个平台中，dPCR 和 BEAMing灵敏度最高，此外，dPCR和COBAS 可以在单个反应中分析多个样本[29]。另一项回顾性研究表明，无论在与组织检测结果的一致性还是检测通量、重复性、检测速度方面，dPCR检测血浆KRAS突变的能力优于COLD-PCR[30]。有研究表明cfDNA 水平与转移性结直肠癌(mCRC) 中的肿瘤突变负荷之间存在良好的相关性[30]，也可通过dPCR技术进行CRC的早期筛查，实现精准防治。在预后判断方面，mCRC患者血浆KRAS突变水平具有预测患者预后和治疗监测的能力。在来自前瞻性多中心AIO KRK0207试验结果显示，利用dPCR技术对患者血浆中的KRAS突变进行量化，可通过检测基线和治疗过程中的KRAS突变情况，预测其OS和PFS[31]。dPCR检测血浆KRAS突变影像学可提早10个月预测疾病进展[32]。可见，dPCR技术检测血浆KRAS突变波动和最终消失可作为预测CRC患者抗EGFR疗效的手段[33]。

3.2dPCR技术与微卫星不稳定性 (MSI)及其临床意义 DNA错配修复缺陷(dMMR)导致DNA微卫星中大量DNA复制错误的积累，这种现象被称为MSI。早期阶段CRC患者dMMR/高度微卫星不稳定性(MSI-H) 的频率为 15%，在 mCRC 中占2%～4%[33]。dMMR/ MSI-H是免疫治疗疗效的预测性泛肿瘤生物标志物。ctDNA微创检测MSI-H是一种很有前途的诊断和治疗监测工具。目前已经开发了一种 dPCR 测定方法来评估微卫星标志物 BAT-26、ACVR2A 和DEFB105A/B。MSI-dPCR 测定在组织和血液样本中得到验证，实现了<0.1%的检测灵敏度，其检测结果与最常用的商业试剂盒 pentaplex-PCR的测定结果100%一致[34]。新的 MSI-dPCR 检测有望成为一种经济、高效、简单、快速的诊断工具，用于检测具有高临床敏感性的 MSI。此外，该测定同样适用于固体和液体活检，还包括具有低 MSI 频率的肿瘤组织样本。

4 dPCR技术与胰腺癌(PC)的无创诊疗

虽然PC并不常见，但其预后极差，病死率极高，已成为全球第7大癌症。已有研究通过多重 dPCR 检测到的KRAS热点突变发现，PC晚期患者KRAS突变水平更高，且与远处器官转移的存在显着相关性[35]，血浆KRAS突变发生率与预后不良有关[36]。在一个局部晚期不可切除的 PC 队列中，治疗后血浆KRAS突变水平显着降低[37]。在一项类似的研究中，研究人员观察到在治疗后 6 个月内无法在血浆中检测到KRAS 突变的患者，其预后更好[38]。这些结果与另一项使用多重 dPCR 测定法检测 16 个KRAS突变的研究结果一致[35]。

5 其 他

周围肿瘤区域中的液体(例如腹膜液)已被证明是有用的 cfDNA 液体活检来源[39]。在腹膜转移 CRC 患者中，在腹膜液中检测到的KRAS或BRAF ctDNA 水平明显高于血浆中的水平[40]。由于尿液收集方便，且具有可重复多次采集等优点，尿液也被列为肿瘤生物标志物液体活检样本，用于疾病进展和药物反应监测。在KRAS阳性 mCRC 队列验证研究中，从尿液和匹配的血浆样本中筛选出KRAS或BRAF突变。尽管二者的一致性很低，但它们表明了使用尿液样本进行非泌尿生殖道肿瘤突变筛查的可行性[41]。

已有研究证明，肿瘤组织周围区域中的其他 DNA 来源(例如外泌体、循环肿瘤细胞和其他体液等)可提供有关疾病演变的信息[39,42]。dPCR技术除了检测血浆中ctDNA外，还可用于血浆外泌体检测。外泌体是细胞主动分泌的囊性结构，可提供有关疾病演变的信息。有研究表明，dPCR用于评估来自外泌体衍生DNA中的KRAS热点突变，灵敏度和特异度分别为75.4%和92.6%，外泌体中的KRAS突变检测在所有阶段都优于血浆cfDNA。此外，局部切除前和切除后突变率分别从66%急剧下降至5%[43]。

6 展 望

液体活检被认为是癌症管理的良好替代和补充工具。通过灵敏度检测技术对特定生物标志物的研究可以指导临床医生在靶向治疗期间监测疾病进展。尽管dPCR已被证明其在检测罕见的可操作突变方面具有很高的灵敏度和特异度，但仍需要进一步的研究以在所有临床实验室实施精准医学。另一方面，相较于数字酶联免疫吸附试验能够提高将免疫检测的灵敏度提高到fg/mL级别，实现了高敏蛋白的检测，dPCR尽管发展更早，却在临床应用方面一直难以取得突破，主要是由于dPCR过程有很多技术难点。因此如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR扩增，如何进行灵敏的信号检测和分析，如何提高自动化程度是实现所谓的第3代PCR临床应用推广的重要突破。