摘 要：山东东阿某养殖场25日龄小型肉鸡，出现生长迟缓、粪便过料、病鸡消瘦、死淘率增加等情况。通过病鸡剖检和病原学核酸检测，结果表明该鸡场存在鸡传染性贫血病毒（Chicken anemia virus，CAV）和圆圈病毒3型（Gyrovirus 3，GyV3）的混合感染。经采取综合防控措施后，本次疫情得到控制。
关键词：鸡;传染性贫血病毒;圆圈病毒3型;混合感染
鸡传染性贫血是由传染性贫血病毒（Chicken anemia virus，CAV）感染鸡而引起，CAV最早于1979年在日本受污染的疫苗中被发现[1]，目前在全世界范围广泛传播[2-5]。14～27日龄小鸡的患病率最高，其临床多表现为贫血、全身淋巴组织萎缩和免疫机能损害，易出现其他病原的并发或继发感染，尤其是当出现多种免疫抑制病共同感染时，会互相增强致病力，在免疫抑制上出现明显的协同效应[6]。此外，近年来在鸡体上分离到了一种与CAV基因结构相似的病毒，被命名为圆圈病毒属3型（Gyrovirus 3，GyV3）[7]，GyV3是一种环状单链DNA病毒，2012年在智利患急性肠胃炎的儿童的粪便中首次被发现[8]，2014年该病毒又从雪貂粪便中被检出[9]。2018年袁世玉等首次从患有传染性腺胃炎的商品肉鸡组织中利用高通量测序的方法检测到GyV3，并且通过基因序列分析确定该病毒属于细环病毒科圆圈病毒属gyrovirus的A分支[10]。该病毒可感染不同品种的蛋鸡和肉鸡，流行较广，主要引起免疫抑制、贫血以及腺胃肿大等症状，感染鸡群发病率一般为 7%～28%，给养禽业带来较大危害[11]。本实验室从山东东阿某杂交肉鸡养殖场发病鸡群中检测到CAV和GyV3显示该鸡场存在这两种病毒的双重感染。现将诊疗情况报告如下：
1 发病情况及临床症状
山东东阿某养殖场25日龄小型杂交肉鸡，出现精神沉郁、鸡冠苍白、生长迟缓、粪便稀薄、含有未消化饲料等情况，病鸡极度消瘦，病死率10%左右，将发病鸡送本实验室进行病原学检测。
2 剖检病变
发病鸡剖检可见腺胃肿胀呈球形，腺胃乳头肿胀甚至消失，脾脏、法氏囊、胸腺明显萎缩，见图1。
3 实验室诊断
3.1 材料与方法
3.1.1 检测所用试剂及仪器 BioSpin胶回收试剂盒、BioSpin组织细胞DNA/RNA共提取试剂盒均购自杭州博日科技有限公司; StarPrep Plasmid Miniprep Kit、2×Taq PCR StarMix with Loading Dye均购自北京康润诚业生物科技有限公司;DL2000 DNA Marker购自TakaRa公司;凝胶成像系统购自济南东岱科学器材有限公司;普通PCR仪、离心机购自Thermo公司;电泳仪购自北京市六一仪器厂。
3.1.2 引物设计 CAV的引物参考从NCBI的GenBank数据库中下载已有的序列，通过Megalign进行序列比对后，根据保守区域的序列进行引物设计，最后选取CAV F/R和GyV-1s/a[12]两对引物用于检测CAV和鸡GyV3，引物序列如下：
CAV F： 5' GGACCATCAACGGTGTTCAG 3'
CAV R： 5' CCTCAAGTCCGGCACATTCT 3'，扩增片段为200 bp;
GyV-1s： 5' TGGTCGTGCGTGGAAAC 3'
GyV-1a： 5' GGTATGAATACGAGCCCTTG 3'，扩增片段为336 bp。
3.1.3 病毒检测 取病鸡组织按1∶5加入pH 7.2的磷酸缓冲盐溶液（PBS） 混合研磨，反复冻融3～5次，12，000 r/min离心10 min;取上清液200 μL用BioSpin组织细胞DNA/RNA共提取试剂盒提取病毒核酸，利用PCR方法进行CAV，GyV3及其他鸡常见病毒的检测。按如下反应体系和循环参数进行：总体积为20 μL的反应体系，包含2×Taq PCR StarMix 10 μL、10 μM 上下游引物0.5 μL、模板DNA 2.0 μL、dd H2O补充至20 μL。
循环参数：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，最后在凝胶成像系统中观察、拍照及记录结果。
3.2 结果
3.2.1 CAV的PCR检测结果 利用3.1.2病毒检测中的CAV的检测引物，按照上述反应体系及循环参数进行PCR检测，结果4份组织均扩增出200 bp左右的条带，与预期的目的条带大小相符，见图2。
3.2.2 鸡GyV3的PCR检测结果 利用3.1.2病毒检测中的GyV3的检测引物，按照上述反应体系及循环参数进行PCR检测，结果4份组织均扩增出336 bp左右的条带，与预期的目的条带大小相符，见图3。
3.2.3 鸡常见病毒的PCR检测结果 鸡的其他常见病毒，包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、腺病毒（FADV）、传染性法氏囊炎病毒（IBDV）、网状内皮增生症病毒（REV）、白血病病毒（ALV）和马立克氏病毒（MDV）PCR检测结果均为阴性，见图4。
结合鸡群发病情况、剖检病变及实验室检测结果，确诊该病例为CAV与鸡GyV3的混合感染。
4 防治措施
鸡CAV和GyV3都属于免疫抑制性病原，一旦感染会使鸡体的抵抗力下降，容易引发其他疾病的混合感染。因此对此类疾病的预防与诊断十分重要。平时应提高鸡舍的饲养管理水平，要保证鸡群日粮中含有丰富的氨基酸、微量元素和维生素，提高机体免疫力[13]。在日常管理过程中，定期对鸡舍、周围环境以及用具等进行消毒。对鸡群定期进行检疫，及时淘汰发病鸡，通过疫苗接种提高鸡群特异性抵抗力。
5 讨论
鸡传染性腺胃炎是一种在家禽养殖生产中较为常见的一类疫病，以鸡群生长不良、消瘦、大小不均、粪便过料等症状为特征，剖检病变可见腺胃肿大，胸腺、法氏囊、脾脏等免疫器官萎缩，该病可发生于不同品种的蛋鸡和肉鸡，常见于雏鸡和青年鸡。由于该病能严重影响家禽的生产性能，给养殖业造成了较大危害。根据之前的报道，传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒、腺胃坏死病毒、禽白血病病毒、网状内皮增生症病毒、呼肠孤病毒等均可能与传染性腺胃炎有关[14-19]。目前，多数学者都认为，传染性腺胃炎是一种病因较为复杂的疾病，除病毒以外，细菌、霉菌毒素等可能都是诱发腺胃炎的重要因素。
本次实验室检测根据临床发病症状及病理剖检特征，对该病鸡场所送病料进行CAV和鸡GyV3的检测，实验结果显示该鸡场存在这两类病毒的双重感染。CAV作为一种免疫抑制性病毒会侵害家禽的免疫系统，导致机体更容易出现其他病原的并发或继发感染，尤其是当出现多种免疫抑制病共同感染时，会互相增强致病力，在免疫抑制上出现明显的协同效应[6]。近年来，CAV在鸡群内蔓延严重，一旦发病，立即隔离病鸡，清理鸡舍中的污染物和排泄物，对鸡舍进行带鸡消毒，对可能受威胁鸡群通过免疫弱毒冻干苗进行预防。特别要注意的是CAV很容易污染疫苗，有研究表明，CAV感染会显着降低禽流感灭活疫苗和活疫苗的免疫效果，对活疫苗的免疫效果影响更大，CAV感染会降低马立克氏病的疫苗免疫功能[20-22]。因此一定要加强疫苗的监管，避免人为造成鸡传染性贫血病的传播。
GyV3最早是从患有胃肠炎儿童和腹泻患者粪便中检测到[8，23]，2018年Li等首次从患有腺胃炎的病鸡腺胃中鉴定出GyV3[11]。袁世玉等[7]对336份腺胃炎病例进行流行病学调查，其中阳性病例为42例，占比12.5%，说明GyV3与腺胃炎具有一定的相关性。刁治君等[24]报道了CAV和GyV3共同感染导致的肉鸡腺胃炎病例，病鸡表现消化不良、粪便过料、均匀度差等症状，与本文病例情况基本一致。对于GyV3来说，因为是近年才在鸡群中发现，目前还没有特异性的疫苗来预防，应以加强饲养管理和提高鸡体抵抗力等措施为注意防控措施。
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