陈 蕤
（广州科技职业技术学院医药营销系，广东广州 510550）
石斛属植物具有很高的药用价值。而多糖类成分是石斛中具有免疫增强作用[1]和抗肿瘤作用[2]的活性成分，常以多糖的含量高低来判断石斛药材质量的高低。本研究对石斛多糖的提取工艺进行优化探讨，为其工业化生产和利用提供理论基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
仪器设备有ESJ120-4型万分之一天平，电热恒温水浴锅，RE-52A型旋转蒸发器，755B型紫外可见分光光度计。
1.2 试药
石斛（四川乐山市歇马乡，经成都中医药大学严铸云教授鉴定为细茎石斛）洗净杀青后于60℃烘干，粉碎，过50目筛备用。本实验所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺[3-5]
取石斛粗粉约 50 g，加入石油醚（60～90℃）250 ml，回流提取1 h，脱脂，过滤，挥干溶剂，加入80%乙醇250 ml，回流提取1 h，过滤，挥干溶剂，加入蒸馏水浸提2次，趁热过滤，减压浓缩至150 ml，0.1%活性炭脱色，过滤，脱蛋白，加入95%乙醇使溶液含醇为80%，于冰箱中静置过夜，沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，烘干，得石斛多糖粗制品。
2.2 加水量的选择
原料与水体积比分别为 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，比较其多糖得率。
2.3 浸提温度的选择
分别在 80、85、90、100℃条件下浸提 3～4 h，比较其多糖得率。
2.4 蛋白去除方法的选择
本实验运用Sevag法、TCA法[5-6]去除石斛多糖中的蛋白质。
2.4.1 Sevag法 多糖提取液，真空抽滤，浓缩至一定体积，按比例加入氯仿-正丁醇混合液，剧烈振荡，以5 000 r/min的转速离心15 min，取上清液。如此反复操作3次。为取得最佳的实验效果，对提取条件设计了正交试验[7]，因素水平见表1。
表1 Sevag法脱蛋白正交设计Tab.1 Factors and their levels of the Sevag method
2.4.2 TCA法 多糖提取液，以5 000 r/min的转速离心15 min，取上清液，加入草酸调整pH至pH=7，加入适量3%的TCA，沉淀蛋白质，调整pH至pH=7，放置过夜，以5 000 r/min的转速离心15 min，取上清液。如此反复操作3次，取平均值。
2.5 粗多糖含量的测定方法
运用苯酚硫酸比色法[8]进行粗多糖含量测定。
2.6 结果
2.6.1 不同加水体积对石斛多糖得率的影响 见图1。
2.6.2 不同浸提温度对石斛多糖得率的影响 见图2。
2.6.3 Sevag法脱蛋白的正交试验结果 石斛多糖提取过程中应用Sevag法脱蛋白的正交试验结果见表2，Sevag法与TCA法比较结果见表3。
表2 正交试验结果Tab.2 Results of the orthogonal test
表3 Sevag法与TCA法提取结果比较Tab.3 Comparison between Sevag method and TCA method
3 讨论
3.1 石斛多糖提取前除杂质
石斛多糖提取前，先用石油醚或乙醚回流提取，可以除去石斛植物中的脂溶性杂质及干扰性色素，而后用80%乙醇回流，除去蛋白质及氨基酸等。
3.2 石斛多糖浸提时加水量的选择
由图1可知，加水量影响石斛多糖得率，随着加水比的增加，石斛多糖的提取率呈上升趋势。若加水比例过少，在没有达到最佳浸提时间之前，浸出液已经变得很少甚至糊锅，从而影响多糖得率[5]。如果加水过多的话，则以后的浓缩过程较繁杂，所以选择原料与水的比例为1∶50。
3.3 石斛多糖浸提温度的确定
由图2可知，在90℃条件下浸提3～4 h，可达到较多的多糖得率。浸提时，温度过低则导致溶剂的渗透能力和溶剂能力降低，使多糖不能有效溶出，温度过高则使得多糖被破坏，使多糖得率降低[4]。
3.4 活性炭脱色
多糖成分中会存在一些残留色素，因此需要用活性炭脱色[9]，加入后应多保留几分钟，使其脱色完全。
3.5 多糖提取过程中脱蛋白方法的选择
可得知 A2B2C3为最佳组合，即 V样品∶V氯仿-正丁醇=1∶1、V氯仿：V正丁醇=10∶2.5、提取时间为 30 min时效果最佳，多糖得率为22.47%。
Sevag法脱蛋白的效果好于TCA法，粗多糖得率及多糖含量均较高，所需时间较短，但Sevag法也存在着重复多次、产生较多有机物质等弊端；而TCA步骤较简单，所用试剂较少，色素物质能在TCA液中随蛋白质沉淀而部分除去，有利于层析精制，但所需时间较长[10]。因此，笔者认为采用Sevag法除去石斛多糖中的蛋白质更为合适。
3.6 多糖沉淀的分离、洗涤、干燥
经乙醇沉淀后的多糖可通滤纸过滤、抽滤或者离心沉淀等分离得到，滤纸表面粗糙，过滤速度慢，消耗时间多，粘在上面的多糖不易洗脱，多糖获得率会因此降低，因此在分离时选用离心沉淀。粗制品烘干前用无水乙醇、乙醚涮洗，可除去多余水分。丙酮需加长洗涤时间、加大用量，尽量除去石斛多糖中的色素。粗多糖的干燥可采用自然干燥、高温烘干等。为实验室操作方便，本实验采用70～80℃烘干至恒重的方法。
本实验确定石斛多糖最佳提取工艺条件为90℃水浸提3～4 h，料水体积比为 1∶50，采用 Sevag法脱蛋白，样品：氯仿-正丁醇=1∶1（V∶V）、氯仿∶正丁醇=10∶2.5（V∶V）、提取时间为30 min，粗多糖得率为1.47%，多糖质量分数为22.47%，需要进一步纯化精制。本结果促进了石斛药材的规模化种植，为药材的工业化生产和利用提供理论基础。
[1]赵永灵,王世林,李小玉.兜唇石斛多糖的研究[J].云南植物研究,1994,16(4):392-396.
[2]王天山.鼓槌石斛中化学成分对K562肿瘤细胞株生长抑制作用体外试验[J].天然产物研究与开发,1997,9(2):1-3.
[3]杨云,冯卫生,孟江,等.正交试验法优选大枣渣多糖水煎煮提取工艺[J].中药新药与临床药理,2003,14(3):200-202.
[4]臧玉红,牛桂玲,李丽娟,等.滑子菇水溶性多糖提取工艺的研究[J].食品科技,2006(11):115-118.
[5]胡雪琼,吴红棉,郝志明,等.平菇多糖的提取工艺[J].湛江海洋大学学报,2004,24(3):65-69.
[6]李瑞,赵浩加,陈乃林.白花蛇舌草多糖除蛋白的方法研究[J].江苏中医药,2003,24(10):56-57.
[7]王叔淳.分析数理统计与质量控制[M].北京:人民卫生出版社,1991:128-145.
[8]张西玉.三种川产人工栽培石斛的多糖含量测定[J].乐山师范学院学报,2004,19(5):88-89.
[9]白玉静,佟丽华.香菇多糖提取工艺和含量测定方法研究[J].黑龙江医药科学,2006,29(1):55-56.
[10]章银良,李红旗,高骏,等.螺旋藻多糖提取新工艺的研究[J].食品与发酵工业,1999,25(2):15-18.
