赵学峰，罗丽贞，区云枝
（南方医科大学附属南海医院，广东佛山 528200）
乳酸菌（lactic-acid bacteria）广泛存在于人、畜、禽的肠道，能够调节机体胃肠道正常菌群生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素、肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应急反应等产生作用。目前，已有众多文献报道利用乳酸菌作为载体表达外源基因，进行疾病的防治；但传统的乳酸菌表达载体为保持一定的选择压力，大多带有1个或多个编码特定抗生素抗性的基因（如红霉素抗性基因等），存在潜在的抗生素耐药性播散的危险。
细菌的营养缺陷型是指细菌的某些基因如管家基因编码的产物催化细菌的基本代谢反应，这些基因突变或缺失后，不能合成相应产物，导致细菌在外界环境中或基本培养基上不能生长，需要补充相应的底物。胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，ThyA）基因编码胸苷酸合成酶，在DNA合成中起关键作用，缺失ThyA基因的菌株在基本培养基上不能生长；染色体整合是一种有效的改造微生物的手段，插入序列、转座子和同源重组是染色体整合的通常形式，其中同源重组的特点是能够按人们所预期的基因位置进行染色体整合[1-2]。
因此，本研究拟利用细菌营养缺陷型互补和同源重组的原理，构建一个可应用于乳酸菌的同源重组载体。利用该同源重组载体可将目的基因整合于消化道共生乳酸菌染色体中，实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达，为构建能高效、安全分泌表达外源目的基因的转基因乳酸菌奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒、培养基和生长条件
大肠埃希菌 DH5α、乳酸乳球菌 MG1363（Lactococcus lactis MG1363）、质粒 pMUTIN4[3]由本室保存。DH5α 常规培养用LB培养基，37℃振荡培养；乳酸菌常规培养在GM17培养基（M17培养基，0.5%葡萄糖），30℃静止培养。氨苄青霉素在E.coli培养中的浓度为 100 μg/ml。
1.1.2 主要试剂和材料
高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DL2000 Marker、限制性内切酶均购自大连Takara公司；M17购自Oxoid公司；质粒抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Sigma公司；引物委托上海英俊公司合成。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 L.lactisMG1363基因组DNA的制备及质粒小量提取
参考革兰阳性菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。主要操作如下：收集适量处于对数生长期的乳酸菌细菌沉淀，加入适量溶菌酶，充分酶解后加入适量无水乙醇混匀，将其全部转移至柱中。充分洗涤后用洗脱液将吸附在柱子膜上的DNA洗脱，采用紫外分光光度法测定基因组DNA浓度，-80℃保存，备用。
参考质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒DNA（碱裂解法）。采用紫外分光光度法测定质粒DNA浓度，-80℃保存，备用。
1.2.2 引物设计及目的基因的PCR扩增
1.2.2.1 引物设计 根据已发表的乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列[4]，用软件Primer 5.0设计引物并引入相应的酶切位点，用作重组质粒的多克隆位点（表1）。引物委托上海英俊公司合成。
1.2.2.2 ThyA基因ATG上游片段（ThyA-up）的PCR扩增与鉴定 PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游1050 bp片断。PCR反应体系如下：5×PCR PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μl，dNTP Mixture 4 μl，模板 2 μl，引物各1 μl，PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μl， 补水至 50 μl。反应条件如下：98℃预变性 30 s；98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃1 min，共30个循环；72℃延伸5 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收纯化目的片段，-80℃保存，备用。
表1 引物序列及其引入的酶切位点Tab.1 The sequences of primers and the introduced restriction enzyme sites
1.2.2.3 ThyA基因终止密码下游片段（ThyA-down）的PCR扩增与鉴定 PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码下游1010 bp片断，以ThyA-down-F和ThyA-down-R为引物，PCR反应体系、反应条件同“1.2.2.2”。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收纯化目的片段，-80℃保存，备用。
1.2.2.4 同源重组载体的构建策略与鉴定 ①纯化后的ThyA-up基因片段与质粒pMUTIN4经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接，转化感受态DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。次日挑取单菌落增菌，提取质粒进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，构建的重组质粒命名为pThyA-up（图1）。②重组载体pThyA-up和制备好的PCR片断ThyA-down经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后连接，转化感受态DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。次日挑取单菌落增菌，提取质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，构建的重组质粒命名为pThyA-up-down（图1）。
2 结果
2.1 ThyA-up基因的PCR扩增与鉴定
以乳酸乳球菌基因组为模板，进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物片段约1050 bp，符合预期片段长度（图 2）。
2.2 重组载体pThyA-up的酶切鉴定
将PCR产物ThyA-up基因经胶回收纯化后克隆到质粒pMUTIN4多克隆位点上，对重组载体进行双酶切鉴定（图3）。结果显示，目的片段ThyA-up已成功连接至质粒pMUTIN4多克隆位点上，表明pThyA-up构建成功。
2.3 ThyA-down基因的PCR扩增与鉴定
以乳酸乳球菌基因组为模板，进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物片段约1010 bp，符合预期片段长度（图 4）。
2.4 将PCR产物经胶回收纯化后克隆到重组质粒pThyA-up，对重组载体进行双酶切鉴定（图5）
结果显示，ThyA-down基因已成功连接至重组质粒pThyA-up（pThyA-up-down）。将乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down进一步测序确证，测序结果显示与理疗序列完全一致（测序图略），表明乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down构建成功。
3 讨论
乳酸菌不产生内毒素，表达的外源蛋白无需经过纯化可以直接连同菌体一起服用，被公认为是安全级（generally regarded as safe，GRAS）微生物；其外源基因容量大，刺激细胞免疫能力强，并可诱导产生大量的细胞因子，亦是理想的基因治疗载体；但无论何种类型的载体都必须带有1个或多个有效的筛选标记以确保重组子的筛选；但如果这种带有抗性基因的菌株投放到环境中或人体、动物体内，由于抗性基因有转移的可能，将为相应抗生素的使用带来严重后果，因此其实际应用必然要受到限制[5]。
由此可见，更安全有效的方法就是将目的基因整合至乳酸菌染色体中，让其在乳酸菌中持续表达，同时又避免了抗性基因的引入（但可通过细菌营养互补筛选重组菌株）。因此，本研究利用细菌营养缺陷型互补和同源重组的原理，构建了可应用于乳酸菌的同源重组载体pThyA-up-down，其全长9900 bp，包括一个来自大肠埃希菌的复制子ColE1，一个报告基因LacZ以及2个筛选标记（selective marker）：来自乳酸菌的ThyA基因和能在乳酸菌中进行抗性筛选的红霉素基因（当整合完成的同时，红霉素抗性基因随之丢失）。此外，目的基因与染色体发生重组是一个随机过程，重组效率很低，后期阳性克隆的获得需要大量的筛选工作；而报告基因LacZ的引入，可在培养基上直接挑取蓝色菌落进行鉴定，从而提高筛选效率，并大大简化阳性克隆筛选的过程。
同源重组的特点是能够按人们所预期的基因位置甚至碱基序列位置进行染色体整合。ThyA是一种广泛存在于原核、真核细胞中的管家基因。ThyA基因编码胸苷酸合成酶，在体内DNA合成中起关键作用，ThyA基因缺失导致dTMP从头合成途径受阻，以至于ThyA缺失株不能在体外环境中生长[6-7]。除非在培养基中添加胸腺嘧啶或胸苷，或导入含有完整ThyA基因野生型序列的互补质粒后，才能使其生存。ThyA基因的上述特点使其成为筛选标志基因。
研究证实，在同源重组的染色体整合中，同源片段越长，整合频率越高，通常情况下，只要达到300 bp的同源片段的同源重组是完全可以成功的[8]。因此，本研究扩增了L.lactis MG1363染色体ThyA基因起始密码上游和终止密码下游各约1000 bp的基因序列作为同源片断，从而提高外源基因在乳酸菌染色体中的整合效率。同时在引物序列中引入6个酶切位点（KpnⅠ、Aor3HⅠ、FseⅠ、BamHⅠ、Sse8387Ⅰ、XhoⅠ），作为同源重组载体的多克隆位点，可根据研究的需要插入不同目的基因在乳酸菌染色体上进行同源重组。pThyA-updown也可携带目的基因在含ThyA基因的其他细菌中进行染色体整合。
在下一步研究中，我们拟利用携外源基因的同源重组载体pThyA-up-down，通过双交叉同源重组，替换乳酸菌基因组中的ThyA基因，实现目的基因在乳酸菌中的整合型表达，而不引入抗药性基因和其他外源基因，使得插入的外源DNA片断最小化，并且不会发生外源基因的水平转移，因此这种乳酸菌同源重组载体具有较高的生物安全性，可望安全有效地应用于相关疾病的防治。
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