党参多糖的气相色谱-质谱联用分析

杨丰榕，苏 强，李瑞燕，高建平

山西医科大学药学院，山西太原 030001

中药党参（Radix Codonopsis）用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消咳[1]。产于山西长治的潞党参[Codonopsis pilosula（Franch）Nannf.]，质量悠久、品质好，为道地药材。党参主要含有多糖、皂苷、甾醇、三萜、生物碱、倍半萜及香豆素类成分等[1]，其中多糖含量最大。现代药理研究表明，党参多糖在调节机体免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗应激、抗氧化等多个方面具有较好的生物活性[2-6]。多糖的功效与其结构和组成有着密切的关系[7]，多糖结构研究的重要环节是对其单糖组成及物质的量之比的分析。本文以产于山西长治的潞党参为材料，提取党参总多糖并进行分离纯化及单糖组成分析，以期得到新的党参多糖，为开展药效学等研究奠定基础。

1 仪器与材料

waters 515 HPLC pump，日本岛津GCMS-QP2010分析仪。

党参总多糖（自制），D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖，D-木糖、L-鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，标准分子量多糖Dextran 180、Dextran 2500、Dextran 4600、Dextran 7100、Dextran 10000、Dextran 21400、Dextran 41100、Dextran 84400、Dextran 133800、Dextran 2000000（中国药品与生物制品检定所产品）；纤维素DE-52（whatman进口分装）。

2 方法与结果

2.1 党参总多糖的制备

依据本实验室已获得的专利方法[8]制备党参总多糖。

2.2 纤维素柱色谱洗脱

取党参总多糖0.5 g溶于10 ml水中，4 000 r/min离心15 min，取上清液上样。100 g DE-52纤维素装柱；蒸馏水、0.05 mol/L NaCl、0.10 mol/L NaCl、0.15 mol/L NaCl、0.25 mol/L NaCl溶液梯度洗脱；体积流量1 ml/min；苯酚-硫酸法沸水反应15 min后紫外分光光度计490 nm检测。合并单一峰，得到5个洗脱组分。取0.10 mol/L、0.15 mol/L NaCl溶液洗脱组分，蒸馏水透析至无 Cl-，40℃真空干燥后得到 CPS’-3、CPS’-4，2个党参多糖。

2.3 高效凝胶渗透色谱法检测党参多糖亚级分纯度及分子量的测定

色谱条件：泵：waters 515 HPLC pump；工作站：Millennium32；检测器：waters 2410 RID；柱子：TSK GMPWXL；检测器温度：35℃；柱温：35℃；流速：0.3 ml/min；流动相：超纯水。

2.3.1 标准品保留时间-分子量标准曲线制定 取多糖标准品分别用蒸馏水配成20 mg/ml的标准溶液，每次进样20 μl，流动相为超纯水，流速0.3 ml/min，测得各标准品的保留时间。以保留时间tR为横坐标，分子量的对数lgMw为纵坐标，得到分子量测定标准曲线。得回归方程为：Y=－0.289 2X+12.163（r=0.999 2），分子量在 2 500～133 800 之间与保留时间tR线性关系良好。

2.3.2 多糖样品分子量测定 分别称取党参多糖分离组分CPS’-3、CPS’-4 适量，蒸馏水配制成 20 mg/ml的溶液，每次进样20 μl，流动相为超纯水，流速0.3 ml/min，测各样品的保留时间。结果见图1～2。

2.3.3 结果 CPS’-3 分子量为 1.15×105、CPS’-4 分子量为200万以上。

2.4 党参多糖的单糖组成分析

2.4.1 多糖的水解 取分子量均一的多糖样品CPS’-3、CPS’-4各30 mg，加入2 moL/L的三氟乙酸 2 ml，封管，100℃水解12 h，取出后N2吹干，备用。

2.4.2 气相-质谱联用色谱分析 采用糖腈乙酰法制备衍生物：分别称取标准单糖和多糖样品水解后的糖样各10 mg，加入盐酸羟胺10 mg，内标肌醇7 mg和吡啶0.5 ml，于90℃水浴加热30 min并振荡，取出冷却至室温，加入醋酸酐0.5 ml，在85℃继续加热30 min进行乙酰化，产物浓缩至干，加入0.5 ml氯仿溶解，溶液经 0.45 μm 滤膜过滤后，0.2 μl进样，气相色谱仪进行分析。

色谱条件：SE30弹性石英毛细管色谱柱；检测器：氢火焰离子化检测器（FID）；程序升温：120℃（5℃/min）～240℃（5 min）；汽化温度 280℃ ；检测器 280℃；载气：高纯氮气。 结果见图 3～10。

2.4.3 标准单糖相对校正因子测定精确称取各个标准单糖，以“2.4.2”的方法进行衍生化，制备糖腈乙酰化衍生物，进行GC-MS分析，并求出定量校正因子f。

（Wi标准单糖质量；Ws内标物质量；Ai标准单糖峰面积；As内标物峰面积）

2.4.4 多糖中各单糖物质的量之比的计算 由以下公式求得各单糖物质的量，进而求出它们物质的量之比。

（N单糖物质的量；Ax单糖峰面积；As内标物峰面积；f该单糖的校正因子；Mr该单糖的分子量）

2.4.5 结果 CPS’-3由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，其摩尔比为 1.5∶2.7∶4.6；CPS’-4 由鼠李糖、 阿拉伯糖、 半乳糖组成，其摩尔比为 1.3∶0.9∶2.6。

3 讨论

气相和质谱联用技术（GC-MS）是目前国际上分析糖类的有效手段，可以同时获得单糖衍生物的保留时间和质谱信号，以时间和质谱信号进行双重定性，能够快速准确地测出多糖的组成以及各单糖之间的摩尔比，结果更可靠[8-9]。据文献报道，张雅君等[10]在党参中发现1个分子量为1.06×106的多糖，利用气相色谱法（GC）分析后可知该党参多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，摩尔比为1∶1.12∶1.13；任丽靖等[11]同样利用GC法分析在党参中发现的1个多糖，该多糖由阿拉伯糖、核糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖及一个未知单糖组成。本文利用DE-52纤维素分离得到了2个党参多糖，分子量为1.15×105的CPS’-3，分子量为200万以上的CPS’-4，通过GC-MS法分析多糖的单糖组成及其摩尔比，与标准质谱图比较后，能够确认气相图谱中每个单糖峰所代表的单糖种类，最终确证CPS’-3、CPS’-4均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，摩尔比分别为1.5∶2.7∶4.6和1.3∶0.9∶2.6，与文献报道的均不相同，是新发现的党参多糖。

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[11]张雅君,梁忠岩,赵伟,等.党参水溶性多糖的分离、纯化及组成分析[J].中国药学杂志,2005,40(14)：1107-1109.

[12]任丽靖,张静,刘志存,等.党参多糖的分离纯化及其结构研究[J].中草药,2008,39(7)：986-989.