microRNA-34a与非小细胞肺癌的关系及其可能调节机制

曾 婷 郝 丽 谢逸欣 马 丽 舒文杰

1.广州军区疾病预防控制中心，广东广州 510507；2.解放军军事医学科学院，北京 100080

microRNA-34a与非小细胞肺癌的关系及其可能调节机制

曾 婷1郝 丽1谢逸欣1马 丽1舒文杰2

1.广州军区疾病预防控制中心，广东广州 510507；2.解放军军事医学科学院，北京 100080

目的 探讨miRNA-34a在非小细胞肺癌发生中的作用及其可能机制。方法 选取56例经病理诊断确诊为非小细胞肺癌患者的癌组织及癌旁组织，RT-PCR法测定miRNA-34a及c-myc mRNA的表达水平，免疫组织化学法检测癌组织及癌旁组织的P53蛋白及c-myc蛋白的表达水平。 结果 癌组织的miRNA-34a的表达水平低于癌旁组织，c-myc mRNA表达及c-myc、P53蛋白表达阳性率高于癌旁组织（P＜0.05）。miRNA-34a与c-myc mRNA表达水平呈负相关关系（P＜0.05）。 结论miRNA-34a对非小细胞肺癌的发生具有一定的调节作用，可能是非小细胞肺癌发生的重要环节，miRNA-34a主要是通过与c-myc的结合而发挥其调节作用。

miRNA-34a；c-myc；P53；非小细胞肺癌

肺癌是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一，具有病死率高、预后凶险的特点。根据组织类型肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC） 和非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）两种[1]，其中，非小细胞肺癌占肺癌总数的80%以上，是肺癌的主要组织类型[2]；非小细胞肺癌患者术后5年生存率不足15%[3]。miRNA是一种长18～24碱基高度保守的单链非编码RNA，它通过与目的RNA的结合从而影响特定基因的蛋白表达[4]，在人体内miRNA类似抑癌基因或致癌基因参与了多种肿瘤的发生发展过程。miRNA-34a是miRNA家族的重要成员之一，其目的RNA为c-myc，miRNA-34a通过与c-myc转录生成的编码RNA结合发挥其抑制肿瘤发生的作用[5]。有研究证实，miRNA-34a对c-myc RNA的调控作用受P53蛋白的调节[6]。本次研究通过对56例非小细胞肺癌患者癌灶及其癌旁组织miRNA-34a、P53蛋白及c-myc蛋白关系的研究，拟探知三者是否在非小细胞肺癌的发生过程中存在类似作用，以期为更好的了解非小细胞肺癌的发生机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年8月～2012年2月在解放军广州军区总医院肿瘤科住院，诊断为原发性非小细胞肺癌的56例患者为研究对象，男41例，女15例，平均年龄（57.0±6.5）岁；患者肺癌类型均经两家三甲医院病理科确诊一致，其中，鳞癌38例，腺癌18例；所有患者均否认术前接受放疗及化疗；肺癌的临床分期参考国际抗癌联盟2009版非小细胞肺癌分期标准，Ⅰ期20例，Ⅱ期18例，Ⅲ期18例，其中有22例发生淋巴结转移。术中留取切除的新鲜癌组织标本及癌旁组织标本，经生理盐水冲洗表面血渍后立即放入液氮罐中保存。

1.2 RNA的提取及RT-PCR法

取50 mg组织标本，加入300 μL生理盐水，匀浆器匀浆后Trizol法提取总RNA（试剂盒购自Invirtogen），并通过异丙醇沉淀法浓缩提取的RNA，提取结束后采用生物分光光度计测定其纯度和浓度。采用TAKARA公司生产的Primer-ScriT reagent（DRR037A）进行逆转录生成 cDNA。U6 小核核糖核酸作为内参。采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System （Foster City，CA）绘制溶解曲线，进行miRNA-34a及c-myc mRNA的相对定量。

1.3 免疫组化法

采用鼠抗人P53单克隆抗体（购自Santa Cruz公司），应用免疫组织化学SP法进行染色，染色过程中注意控制染色时间及温度，染色时以PBS溶液代替一抗进行平行对照。P53蛋白主要在细胞核表达，胞核中出现棕褐色颗粒说明染色阳性。计算阳性染色率时在10个高倍镜视野中随机选取3个进行阳性率判定，最后取其均值作为P53蛋白表达阳性率的代表，若阳性率高于30%则定义为阳性。c-myc蛋白的免疫组织化学检测原理及方法同P53蛋白（一抗为鼠抗人单克隆抗体）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，癌组织及癌旁组织miRNA-34a及c-myc mRNA表达水平比较采用配对t检验；计数资料用率表示，肺癌组织及癌旁组织P53、c-myc蛋白表达阳性率比较采用χ2检验；miRNA34-a表达水平与P53、c-myc蛋白表达相关性分析采用Spearman秩相关。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组织及癌旁组织的miRNA-34a和c-myc mRNA表达水平比较

肺癌组织miRNA-34a的相对表达量为 （1.18±0.25），癌旁组织为（1.67±0.31）；癌组织 c-myc mRNA 表达量为（0.39±0.12），癌旁组织为（0.16±0.09）。 非小细胞肺癌组织miRNA-34a及c-myc mRNA的相对表达量高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。由图2可知，miRNA34-a与c-myc mRNA表达呈负相关关系，随着miRNA34-a表达量的增加c-myc mRNA表达水平下降（r=-0.80，P＜0.05）。

2.2 肺癌组织及癌旁组织的P53、c-myc蛋白表达水平比较

采用免疫组织化学法染色后，发现在56例肺癌组织标本中有29例P53蛋白呈阳性表达，占51.79%，在癌旁组织中有4例呈阳性表达，表达率为7.14%；不同组织类型P53蛋白的阳性表达率差异有高度统计学意义（P<0.01），见表1，图3。癌组织标本中c-myc蛋白阳性表达33例，占58.9%，癌旁组织中阳性表达2例，占3.6%，不同组织类型c-myc蛋白的阳性表达率差异有高度统计学意义（P<0.01），见表1、图3。

表1 不同组织类型P53蛋白及c-myc蛋白表达情况（例）

2.3 miRNA-34a及c-myc mRNA与P53、c-myc蛋白表达的关系

在P53蛋白表达判定为阳性的癌组织和癌旁组织中，miRNA-34a 的表 达 水平 为 （1.09±0.25），c-myc mRNA 为（0.45±0.11）；在判定为阴性的癌组织及癌旁组织中miRNA-34a 的表达水平为（1.54±0.32），c-myc mRNA 为（0.20±0.11）。见图4。c-myc蛋白表达阳性的肺癌及癌旁组织中miRNA-34a 的表达水平为（1.17±0.25），c-myc mRNA 为（0.43±0.12），在判定为阴性的癌组织及癌旁组织中miRNA-34a的表达水平为（1.48±0.36），c-myc mRNA 为（0.23±0.13），见图 5。

3 讨论

现代医学理论认为，癌症的发生是多因素参与、基因与环境交互作用导致的一种细胞凋亡异常状态。以往对于肺癌遗传易感性的研究多集中在DNA水平，如SNP突变[7]（cyp1a1 m1 位点的 T-C 突变）、基因缺失[8]（GSTT、GSTM 缺失）以及特定基因的甲基化状态（CDH13、p16基因）[9-10]。但是单纯的DNA水平的研究并不能解释完全解释肺癌的遗传易感性。近年来有研究发现，非编码RNA在癌症的发生过程中起到了致癌或抑癌基因的作用，miRNA的作用机制主要是与靶基因的目的mRNA结合从而影响目的基因的转录及翻译水平。miRNA-34a是miRNA-34家族的主要成员之一，miRNA-34a在人体内的目的mRNA为cymc，c-myc蛋白在人体内主要作用是促进细胞进入S期完成DNA的合成复制。c-myc的过度表达被认为是肿瘤发生的强烈信号。miRNA-34a通过与c-myc的结合降低c-myc蛋白的表达水平，从而发挥其抑制肿瘤发生的作用。

本次研究发现，癌组织miRNA-34a的表达水平低于癌旁组织，c-myc mRNA水平高于癌旁组织；miRNA-34a与cmyc mRNA呈负相关关系，一定程度的证实了c-myc mRNA为miRNA-34a的靶向基因。免疫组织化学发现，c-myc蛋白表达水平较低的癌旁组织其c-myc转录水平也较低。研究还发现，癌组织中的P53蛋白表达水平高于癌旁组织。P53蛋白阳性组织的miRNA-34a的水平要低于P53蛋白表达阴性者。这与以往研究发现的P53蛋白对miRNA-34a具有调节作用相一致，但是作用方向却相反，这可能是由于以往研究发现的是P53调节蛋白而不是组织中的P53蛋白对所miRNA-34a起的作用。另外，本次调查对P53蛋白的测定采用免疫组织化学法，而非以往研究的western blot法，且以往的研究是细胞培养发现的结果，而本次研究直接取材于癌组织，具有一定的局限性。

总之，本次研究发现miRNA-34a对肺癌的发生具有一定的调节作用，可能是肺癌发生的重要环节，miRNA-34a主要是通过与c-myc的结合而发挥其调节作用。

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The relationship between microRNA-34a and non small-cell lung cancer and its possible regulation mechanism

ZENG Ting1HAO Li1XIE Yixin1MA Li1SHU Wenjie2
1.Center for Disease Control and Prevention in Guangzhou Military Region,Guangdong Province,Guangzhou 510507,China;2.Academy of Military Sciences,Beijing 100080,China

Objective To explore the effect of miRNA-34a on the occurrence of small cell lung cancer(SCLC)and its possible mechanism.Methods Lung cancer tissues and its corresponding non cancer tissues in 56 cases of patients who diagnosed as SCLC by pathology were collected for detecting its miRNA and c-myc mRNA expression by RT-PCR.Immunohistochemistry method was used for detecting P53 and c-myc protein expression in cancer tissue and its corresponding non cancer tissues.Results Compared with corresponding non-cancer tissues,the expression of miRNA-34a in lung cancer tissuewaslower,howevertheexpressionofc-mycmRNA,c-mycproteinandP53proteinwerehigher(P＜0.05).There was a negative correlation between miRNA-34a and c-myc mRNA expression level(P＜0.05).Conclusion miRNA-34a plays a regulating role on the occurrence of SCLC,and it may be an important factor on SCLC occurrence by combination with c-myc.

miRNA-34a;c-myc;P53;SCLC

R734.2

A

1673-7210（2012）08（b）-0005-03

国家自然科学基金青年科学基金项目（30700139）。

2012-05-14 本文编辑：程 铭）