赵桂芝 王绪平 黄孝闻 杨明艳 寿旦
1.浙江省中医药研究院，浙江杭州310007；2.浙江中医药大学，浙江杭州310053
颈总动脉结扎联合半乳糖注射制备老年期痴呆大鼠模型及行为学评价研究
赵桂芝1王绪平1黄孝闻1杨明艳2寿旦1
1.浙江省中医药研究院，浙江杭州310007；2.浙江中医药大学，浙江杭州310053
目的探讨不同制备方法对痴呆大鼠模型学习记忆能力的影响，为药效评价提供老年期痴呆大鼠模型。方法40只Wistar雄性大鼠随机分为5组：分期双侧颈总动脉永久结扎后D.半乳糖注射组(A组)；D.半乳糖注射后分期双侧颈总动脉永久结扎组(B组)；单次双侧颈总动脉永久结扎组(C组)；D.半乳糖注射组(D组)，正常对照组(E组)，每组8只。除E组外，A组左侧颈总动脉结扎，间隔1周后行右侧颈总动脉结扎术；并于结扎术1周后行D.半乳糖腹腔注射(60 mg/kg体重，每天1次)，共连续注射42 d；B组腹腔连续注射D.半乳糖(60 mg/kg体重)42 d后，再行双侧颈总动脉永久结扎术；C组仅行双侧颈总动脉永久结扎术42 d，腹腔不注射半乳糖；D组：仅连续腹腔注射D.半乳糖(60 mg/kg体重)42 d，不接扎其双侧颈总动脉。最后采用Morris水迷宫行为学测试法进行定位航行及空间探索实验；取各组大鼠海马CA1区进行电镜观察。结果与C、E组相比，A、B及D组游泳时间与距离均明显缩短，差异有统计学意义(P＜0.01)；而A组与B、D组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；比较正常组各模型组海马CA1区锥体细胞有不同程度的丢失，且脑组织病理学改变明显。结论采用双侧颈总动脉永久结扎联合半乳糖腹腔注射方法，制备的老年期痴呆大鼠模型，记忆力明显减退，且脑组织病理学显着改变，能有效重现老年期痴呆患者的发病特点。
老年期痴呆；行为学评价；学习记忆；组织病理学
随着老龄化社会到来，老年性痴呆发病率持续上升，老年痴呆患者人群不断扩大，其中以阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)及血管性痴呆(vascular dementia，VD)为主，两种类型痴呆的临床表现、神经生物化学及神经生理学特点存在不同程度的交错；相关研究已证实两者在发病机制及病理变化方面存在本质的相似［1.4］。由于在临床痴呆人群中，“混合性痴呆”具有较高的流行趋势［5］，现有的模型制备通常将两者严格区分，笔者前期已优化血管性痴呆大鼠模型制备方法［6］，研究证实脑衰老及脑低灌注是AD及VD发病过程中的两大关键因素［7.10］。
基于AD和VD发病的多因性及相似性，本文尝试利用腹腔注射半乳糖促老化，分期永久结扎双侧颈总动脉致脑低灌注的方法，制备脑衰老与脑低灌注两种关键因素联合作用的痴呆大鼠［11］。并进一步通过大鼠的学习记忆和空间记忆等行为学改变［12］，以及脑海马组织病理学改变进行模型验证与评价，以期为老年期痴呆的发病机制及药物作用评价研究提供动物模型。
1 材料与方法
1.1 设备、材料与试剂
Morris水迷宫实验仪及Ethovision 3.0分析软件(荷兰)；DM2500生物显微镜(德国徕卡)；D.半乳糖(D.galactose)，购自美国Sigmal试剂公司；手术剪、止血钳、眼科弯镊、缝针及0～3号缝线。
1.2 实验动物与分组
1.2.1 实验动物Wistar大鼠，雄性，体重190～210 g，购自上海思莱克实验动物有限责任公司，饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK(浙)2009.0122。
1.2.1 分组实验大鼠40只，随机分为5组，每组8只。A组：分期双侧颈总动脉永久结扎后D.半乳糖注射组(2VO+Gal组)；B组：半乳糖注射后分期双侧颈总动脉永久结扎组(Gal+2VO组)；C组：单次双侧颈总动脉永久结扎组(2VO组)；D组：半乳糖注射组(Gal组)；E组：正常对照组。
1.3 手术操作
A组：术前8～12 h禁食不禁饮水，10%水合氯醛以350 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，仰卧位固定于保温手术台上，颈部皮肤备皮消毒后行颈侧向切口，用0号丝线永久结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤。复苏后正常饲养，观察手术创口愈合情况，1周后行右侧颈总动脉结扎术。术后第8天开始腹腔注射D.半乳糖，剂量60 mg/kg，每天1次，连续注射42 d。
B组：先腹腔注射D.半乳糖42 d，第41、48天分期行双侧颈总动脉永久结扎术，其余处理同A组。
C组：仅一次性双侧颈总动脉永久结扎，不注射半乳糖，其余处理同A组。
D组：仅腹腔注射D.半乳糖42 d，不行颈总动脉接扎术，其余处理同A组。
E组：不给予任何手术或药物处理，与前4组大鼠同等条件饲养。
1.4 行为学实验
实验系统主要由圆形不锈钢水池(直径和深度分别为1.50 m和0.45 m)及图像自动采集、处理系统组成。池内加水至水位高度为0.38 m，水中加碳素墨水使之浑浊，水温(22±2)℃。水面以原点为中心均等划分为L、P、R、O四个象限区，在P区中央放置一圆形有机玻璃平台(直径12 cm，高度0.36 m)。从与平台相对的象限区(即O象限)，自距水面20 cm高度处以面向池壁方式抛投大鼠入水，到达平台顶部后在平台上休息30 s后重复操作，记录其自入水至登上平台所需的时间(即逃避潜伏期)、游泳路径与游泳距离。如果大鼠180 s内未到达平台，则由实验者引导其至平台，此时潜伏期为最高值(180 s)。实验共进行7 d，前5天进行同样的定位航行训练，每天1次；第6天将实验入水点改为相邻的左侧象限(L象限)区，同法操作并记录数据；第7天行空间探索实验，即撤去平台，并将大鼠入水点恢复为O象限，观察大鼠入水后60 s内的游泳情况并记录路径。A、D组于腹腔注射D.半乳糖后42 d，B、C组大鼠于双侧颈总动脉永久结扎术后1周，与E组大鼠同时进行行为学实验。
记录大鼠在水池各象限区的游泳距离与时间，并分别计算其占游泳总距离与总时间的百分比，以此作为大鼠学习记忆成绩的评价指标。
1.5 脑海马病理组织学观察
1.5.1 病理切片制片及染色行为学实验结束后，将每组大鼠断头处死，在冰盘上小心迅速取出完整脑组织，剥离出双侧海马组织，用5%甲醛固定24 h，经系列梯度酒精脱水，石蜡包埋后切片，并采用苏木素.伊红HE染色［13］，于电镜下观察海马的病理变化。
1.5.2 脑海马病理组织学改变判断方法脑缺血所致的脑神经细胞损伤与死亡，受损细胞类型与脑缺血的诱因、程度以及持续时间直接相关。由大脑中动脉(MCA)梗塞引起的脑缺血时，缺血中心区域的损伤表现以神经元细胞(如纹状体、皮层神经元、海马)坏死为主，表现为核固缩、破裂，细胞分界线消失。缺血梗死灶边缘区域则以神经元细胞凋亡为主，表现为细胞体积变小、胞浆皱缩、胞核固缩等［15］。
1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差(s)表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物外观及行为活动
A、B及D组大鼠在半乳糖注射过程中，均逐渐出现行为异常，如活动减少、动作迟缓、精神不振等。A、B、C组大鼠颈总动脉永久结扎后，C组大鼠死亡2只，补充2只。C组术后有1只出现眼睑下垂，术后第1天时大鼠自发活动均有所减少，但术后2 d后，除C组外的其余各组基本恢复至术前状态，C组4 d后恢复术前状态，各组饮水、摄食均未见明显异常。
2.2 行为学分析结果
行为学分析结果见表1、2。由表1可知，C、E组间差异无统计学意义(P＞0.05)，而A、B及D组时间比与距离比均较C、E组减小，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。但A组与B、D组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。表2显示A、B、D组大鼠在P象限的游泳时间显着少于正常对照组。
表1 空间探索实验中各组大鼠原平台象限游泳时间比与距离比分析s）
表1 空间探索实验中各组大鼠原平台象限游泳时间比与距离比分析s）
注：与E组比较，*P＜0.01；与C组比较，#P＜0.01
组别只数P象限游泳时间占总时间比P象限游泳距离占总距离比A组B组C组D组E组8 8 8 8 8 0 . 2 9 ± 0 . 0 4*#0 . 2 6 ± 0 . 0 4*#0 . 5 0 ± 0 . 0 8 0 . 3 0 ± 0 . 0 3*#0 . 5 0 ± 0 . 0 6 0 . 3 0 ± 0 . 0 3*#0 . 2 7 ± 0 . 0 5*#0 . 4 8 ± 0 . 0 6 0 . 2 9 ± 0 . 0 3*#0 . 4 6 ± 0 . 0 5
表2 空间探索实验中大鼠各象限游泳距离及游泳速度比较（s）
表2 空间探索实验中大鼠各象限游泳距离及游泳速度比较（s）
注：与E组比较，*P＜0.01；与C组比较，#P＜0.01
组别只数游泳速度( c m / s )各象限游泳距离( c m ) P L O R A组B组C组D组E组8 8 8 8 8 4 3 8 . 8 ± 9 1 . 3*#4 0 8 . 9 ± 7 7 . 8*#6 6 4 . 9 ± 7 4 . 5 4 0 6 . 1 ± 8 6 . 4*#6 3 3 . 6 ± 9 6 . 4 3 3 6 . 9 ± 1 3 5 . 1 3 1 0 . 2 ± 1 1 3 . 9 2 7 9 . 6 ± 1 0 9 . 9 2 9 2 . 0 ± 1 5 2 . 3 2 5 1 . 8 ± 4 7 . 2 3 0 5 . 0 ± 7 1 . 6 3 7 7 . 3 ± 7 5 . 4*#2 3 8 . 0 ± 6 0 . 6 3 7 1 . 5 ± 3 8 . 7*#2 2 8 . 7 ± 4 9 . 8 3 4 8 . 5 ± 1 3 8 . 6 4 2 6 . 8 ± 1 4 7 . 7#2 0 9 . 9 ± 7 0 . 0 3 0 5 . 5 ± 8 8 . 9 2 4 4 . 3 ± 4 5 . 8 2 4 . 3 ± 5 . 1 2 5 . 4 ± 2 . 8 2 3 . 2 ± 1 . 6 2 2 . 9 ± 4 . 1 2 2 . 6 ± 1 . 5
2.3 脑海马病理组织学改变
各组脑海马病理组织学改变见图1。E组大鼠海马CA1区树突呈条索状分布，锥体细胞3～4层，排列紧密、整齐；胞体完整，界线清晰，无变性坏死，胞核大而圆。A、B组大鼠海马CA1区树突明显破坏，几乎呈阴性染色，锥体细胞减少，细胞1～2层，排列松散，界限不清；可见变性坏死细胞，核固缩、破碎，呈深蓝色，胞浆浓缩；C、D组海马细胞丢失，排列紊乱，周围结缔组织增生情况较模型组明显减少。
图1 海马组织CA1区HE染色切片（200×）
3 讨论
以双侧颈总动脉同时永久结扎的方法制备的痴呆大鼠模型，由于短时间脑内供血骤降，易导致较高的动物死亡率。本文采用间隔1周，分期手术的方式结扎双侧颈总动脉，在手术间隔期，椎动脉缓慢代偿性供血，逐渐形成前脑供血不足的病理状态，其过程及表现与临床慢性脑缺血更为接近［16］，且大鼠死亡率下降，术后恢复较快。因而采用分期颈总动脉永久结扎方式用于老年期痴呆大鼠的模型制备，具有动物死亡率低，术后运动功能恢复快，病理特征与临床相似等特点。
本研究中的大鼠模型结合了脑衰老与脑低灌注两种关键因素的作用，利用腹腔注射半乳糖促老化，使大鼠体内产生大量超氧阴离子自由基，对脑组织产生过氧化损害；同时由于细胞内存积D.半乳糖后干预了细胞内物质代谢，细胞代谢功能下降，导致鼠快速衰老［17］；永久结扎双侧颈总动脉则导致脑内低灌流，细胞代谢能力进一步下降。两种因素共同作用，使模型大鼠呈现明显的学习、记忆能力减退特征，具备了老年期痴呆的临床表现。且该造模过程较符合老年期痴呆临床患者的病理历程，因而适用于研究痴呆患者脑组织的形态及病理、生理变化，能够为老年期痴呆的基础研究及药效评价提供有益参考。
此外，术后7 d，A组大鼠的原平台象限游泳距离比、时间比等各项指标与B、D组比较，差异均无统计学意义，提示低灌注联合半乳糖诱导记忆功能损伤无长期效应，此种现象可能与机体自身代偿有关。据此推断本模型仍属急性.亚急性范畴，提示下一步工作应致力于更具实用性的亚急性.慢性模型研究工作。
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Studyonratsmodelofseniledementiabyligationofcarotidarteriescombined with injection of D-galactose and its application for behavioral evaluation
ZHAO Guizhi1WANG Xuping1HUANG Xiaowen1YANG Mingyan2SHOU Dan11.Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Zhejiang Province,Hangzhou310007,China;2.Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Province,Hangzhou310053,China
Objective To explore the effect of different preparation methods on learning and memory of senile dementia rats model,and to offer effective rats model for efficacy evaluation.Methods Totally 40 male Wistar rats were randomly divided into five groups:2.VO+D.galactose injected group（group A）;D.galactose injected+2.VO group（group B）; 2.VO group（group C）;D.galactose injected group（group D）;normal control group（group E）;8 rats in each group.Except the group E,unilateral common carotid artery were permanently ligated in the rats of group A,the other lateral artery then were permanently ligated after 7 days.With the interval of one week,the rats were injected with D.galactose（60 mg/kg,once every day）for 6 consecutive weeks.The rats of group B were injected with D.galactose（60 mg/ kg）for 6 consecutive weeks,then their bilateral common carotid arteries were permanently ligated,the bilateral common carotid arteries were permanently ligated only in the rats of group C.The rats of group D were injected peritoneally with D.galactose for 6 consecutive weeks only.Finally,the water maze experiment was taken to explore the place navigation and spatial experiments;and their hippocampal CA1 region in the rats of each group were observed with electron microscope.Results Compared with group C and E,the swimming time and distance in the rats of group A,B and D reduced obviously（P＜0.01）,but there were rarely differents between the rats of group A with the rats of group B and D（P＞0.05）.Compared with normal group,obvious loss of pyramidal cells hippocampal CA1 were found in every other group,and their cerebral pathology had significantly changes.Conclusion The senile dementia rats model established by the method of permanent bilateral common carotid artery ligation combined with intraperitoneal injection with D.galactose shows obvious loss in learning and memory,and has significant changes in their cerebral pathology, which represent the characteristics of the Senile dementia.
Senile dementia;Learning and memory;Behavioral evaluation;Histopathology
R332
A
1673-7210（2014）02（a）-0034-04
2013.08.28本文编辑：卫轲)
浙江省科技计划项目(编号2012F10022)。
