王小雪 党 磊 张美姿 郭飞马 庞 欣

航天神舟生物科技集团有限公司生物医药研究所 北京市空间生物工程技术研究中心，北京 100190

辅酶Q10具有皮肤修复功效，其在个人护理产品中应用逐渐增多。辅酶Q10的生理作用包括抑制线粒体氧化和激活皮肤细胞代谢，降低皮肤成纤维细胞中活性氧（ROS）水平，抑制细胞凋亡[1-3]；还可降低皮肤成纤维细胞中由于紫外线损伤造成的金属蛋白酶水平升高，促进皮细胞增殖，增加成纤维细胞中Ⅳ和Ⅶ型胶原表达。上述文献表明辅酶Q10其具有抗皮肤氧化、抗衰老作用。辅酶Q10还可通过抑制酪氨酸激酶活性来降低B16细胞中黑色素的生成，达到美白的效果。因此在个人护理品中添加辅酶Q10也日渐普遍，用于预防和修复皮肤光老化[4-7]。

但是辅酶Q10分子量大，在水中溶解度低，造成其生物利用度低，不易透皮吸收，这一问题限制了辅酶Q10在化妆品中的应用。已有研究将辅酶Q10制备成纳米脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）、固体脂质纳米粒、纳米微囊与极微小纳米脂质载体等，增大辅酶Q10在人皮肤成纤维细胞与离体皮肤组织的吸收，但是这类制剂稳定性较低。微乳给药系统通过增加药物溶解度来提高通透浓度梯度，增加角质层脂质双分子层流动性等方式促进药物经皮吸收，可用于制备稳定的辅酶Q10制剂[8-14]。

1 材料与仪器

1.1 材料

辅酶Q10（神舟生物科技有限公司）；辅酶Q10标准品（美国Sigma公司）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（Cremophor RH-40，德国BASF公司）；单硬脂酸三聚甘油酯（TGMS）（瑞士LONZA公司）；甲醇为色谱纯，乙醇为分析醇。

人胚胎成纤维（ESF）细胞、永生化上皮（Hacat）细胞购自北京协和细胞资源中心；DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；ROS试剂盒（碧云天生物技术公司），人源基质金属蛋白酶 1（MMP-1）ELISA 试剂盒（美国 R&D Systems，Inc.公司）。蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术公司）。

1.2 仪器

2996型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；RCTBasic型恒温磁力搅拌器（德国IKA公司）；NS1001L高压均质机（意大利Niro Soavi公司）；Mastersizer 2000型激光散射粒径测定仪（英国Malven公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific公司）；紫外辐照源（美国Spectroline公司）；荧光分析仪（美国Thermo Scientific公司）。

2 方法

2.1 辅酶Q10微乳含量测定方法

按照《中国药典》2010版[15]方法测定辅酶Q10微乳含量。色谱柱：waters Symmetry C18（5 μm，3.9 mm ×150 mm）；流动相（甲醇∶乙醇=50∶50）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；温度：25℃；进样：20 μL。取辅酶Q10 标准品溶液，按照 4、10、20、40、50 μg/mL 梯度稀释，采用无水乙醇定容，依次进样，根据浓度与峰面积比建立标准曲线。

精密度试验：取同一标准品溶液，重复进样6次，每次20 μL，按上述色谱条件测得峰面积。

2.2 辅酶Q10微乳的制备

采用聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40）与TGMS作为辅酶Q10微乳的乳化剂[16]。将两种乳化剂依照1∶1（W/W）的比例准确称取后充分混合均匀，作为混合表面活性剂。将混合表面活性剂与辅酶Q10依照1∶1（W/W）混合后，65℃水浴，磁力搅拌滴加水相，形成5%辅酶Q10粗微乳。将粗微乳液样品通过高压均质机在80 MPa压力下均质3次，制备得到辅酶Q10微乳液。

2.3 微乳理化指标评价

采用激光粒度仪测定辅酶Q10的粒径与Zeta电位。取微乳样品5.0 g，测定pH值。旋转式黏度计测定微乳黏度。取微乳样品10.0 g装于离心管中，4000 r/min离心30 min，观察微乳外观性状。

2.4 长期稳定性

取3批辅酶Q10微乳样品，棕色西林瓶中密封包装，置于25℃，RH 60%的药品稳定性试验箱中12个月，在第0、3、6、12个月月末分别取样1次，观察乳剂外观性状，采用“2.3”项下方法评价微乳稳定性，测定微乳pH值，并按照“2.1”项下方法测定辅酶Q10含量。

2.5 辅酶Q10微乳体外抗紫外辐射实验

2.5.1 细胞培养 具体方法参照国家实验细胞资源平台提供的关于ESF、Hacat细胞培养方法[5]。简要步骤：分别将ESF、Hacat细胞置75mL细胞培养瓶内，加入含10%的胎牛血清及1%抗生素的DMEM培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2.5.2 UVA、UVB辐射损伤细胞模型的建立 Hacat细胞和ESF细胞接种于12孔板中（1×105/孔），使用DMEM培养基，用含10%胎牛血清（FBS）的培养液培养24 h后，将细胞分为空白对照组、模型组、空微乳组、辅酶Q10 微乳不同剂量 [1、5、10 μmol/L， 磷酸盐缓冲液（PBS）作为溶媒]组。空微乳和辅酶Q10不同剂量组加入药物处理，空白对照组和模型组加入等体积溶媒，以上处理细胞继续培养24 h。细胞用PBS清洗后，除空白对照组外，其余各组细胞放入紫外辐照箱中进行UVA（320～400 nm，峰值 365 nm）、UVB（280～320 nm，峰值312 nm）辐照损伤。UVA处理Hacat细胞辐照剂量为14 J/cm2，处理ESF细胞辐照剂量为15 J/cm2。UVB处理Hacat细胞辐照剂量为20 mJ/cm2，处理ESF细胞辐照剂量为60 mJ/cm2。紫外处理后，PBS清洗细胞，按前述分组继续处理24 h。

2.5.3 细胞内ROS的检测 使用ROS检测试剂盒进行胞内ROS水平的检测。荧光信号使用荧光分析仪进行，激发波长为485 nm，发射波长为538 nm。同时检测蛋白含量对结果进行校正，蛋白含量测定使用聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白浓度测定试剂盒进行检测。

2.5.4 ESF细胞外MMP-1的检测 采用人源MMP-1 ELISA试剂盒检测经UV辐射后ESF细胞培养基中MMP-1水平。BCA蛋白浓度测定试剂盒对总蛋白含量结果进行校正。

2.6 统计学方法

所有数据使用SPSS 11.5软件进行处理分析，计量资料采用均数±标准差（）表示。多组间均数比较采用One-way ANOVA，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 辅酶Q10微乳含量测定方法

在该分析方法下，乳剂中的辅料对药物的测定无干扰。该法用于检测微乳中辅酶Q10的含量，专属性良好。以辅酶Q10峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标进行线性回归。得回归方程为：A=20508 C-28861，r2=0.9997，线性范围为 4～50 μg/mL。重复进样，测定辅酶Q10的峰面积，计算相对标准差（RSD）为0.04%（n=6），表明仪器精密度良好。

图1 空微乳（A）、辅酶Q10微乳（B）、辅酶Q10标准品（C）色谱图

3.2 辅酶Q10微乳理化指标评价

用激光粒度仪测得辅酶Q10微乳的平均粒径为（225.2±23.76）nm，测得 Zeta 电位为-（39.5±6.06）mV。实验结果表明，pH计测得微乳pH为（6.12±0.04），使用旋转式黏度计测定20℃下微乳黏度，结果为1.0 Pa·s，其黏度与水的黏度相近。

辅酶Q10微乳经4000 r/min离心30 min，无分层、无沉淀；外观性状无明显变化。辅酶Q10微乳在第 0、3、6、12 个月月末取样时（n=6），外观性状、离心稳定性、含量测定的结果见表1。

表1 辅酶Q10微乳液长期稳定性考察（）

表1 辅酶Q10微乳液长期稳定性考察（）

放置时间 外观性状 稳定性考察 pH值 含量（%）0个月3个月6个月12个月橙黄色均匀水溶液橙黄色均匀水溶液橙黄色均匀水溶液橙黄色均匀水溶液无沉淀、无分层无沉淀、无分层无沉淀、无分层无沉淀、无分层6.12±0.04 6.04±0.05 5.83±0.11 5.76±0.15 5.55±0.35 4.83±0.13 4.67±0.11 4.62±0.06

3.3 辅酶Q10微乳对ESF、Hacat细胞内ROS水平的影响

UVA、UVB辐照会对ESF、Hacat细胞造成氧化损伤，致使模型组细胞中ROS水平明显升高（P＜0.01），该结果表明模型建立成功。各剂量（1、5、10 μmol/L）辅酶Q10微乳均能明显降低UVA照射后的Hacat细胞中的 ROS 水平（P ＜ 0.05）；高剂量（10 μmol/L）辅酶Q10微乳能显着降低UVA照射后的ESF细胞中的ROS 水平（P ＜ 0.01）。中高剂量（5、10 μmol/L）辅酶Q10微乳能明显降低UVB照射后的Hacat细胞中的ROS 水平（P ＜ 0.05）；中高剂量（5、10 μmol/L）辅酶Q10微乳显着降低UVB照射后的Hacat细胞中的ROS水平（P ＜ 0.01）。见图 2。

图2 辅酶Q10微乳对紫外辐射后ESF、Hacat细胞内ROS水平影响

3.4 辅酶Q10微乳对ESF细胞MMP-1表达的影响

与空白对照组比较，模型组经UVA、UVB照射后，细胞上清液中MMP-1含量均明显升高（P＜0.01），该结果表明模型建立成功，紫外线对皮肤细胞具有损伤作用。与模型组比较，空微乳组对MMP-1含量没有影响。UVA 照射后，中高剂量（5、10 μmol/L）给药组MMP-1含量明显降低（P＜0.05）；UVB照射后，各剂量（1、5、10 μmol/L）给药组 MMP-1 含量显着降低（P ＜0.01）。见图 3。

图3 辅酶Q10微乳对紫外辐射后ESF细胞MMP-1影响

4 讨论

辅酶Q10由于分子量大，不溶于水，不易被表皮吸收[17]。有文献采用中链脂肪酸辛酸癸酸三甘油酯、向日葵卵磷脂、乳化蜡作为油相，增大辅酶Q10的溶解度，制成纳米颗粒、微囊、微乳等剂型[11，18-19]。但是此方法会增大表面活性剂的用量。本研究利用辅酶Q10熔点低（49℃）的特点，将制备温度控制在60℃以上，不使用油相溶解辅酶Q10，保持辅酶Q10熔化状态与表面活性剂混合均质，成为分布均匀的微乳液，此方法可以减少乳化剂的用量。

皮肤用微乳的制剂载体所选组分必须考虑皮肤刺激性。已有文献采用聚氧乙烯（20）十八烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、泊洛沙姆188制备辅酶Q10微乳[19-21]。本研究选用化妆品工业中常使用的聚氧乙烯氢化蓖麻油和单硬脂酸三聚甘油酯，较其他乳化剂刺激性较弱，皮肤使用安全性较高。本研究利用上述复合乳化剂制备了辅酶Q10 O/W微乳，理化性质结果显示，制得的辅酶Q10 O/W微乳平均粒径为235 nm左右，平均Zeta电位为-（39.5±6.06）mV，该粒度分布可使乳剂在较长时间内保持其物理稳定性。乳滴表面所带负电荷可使乳滴之间产生相互排斥力，从而防止乳滴相互聚集，提高其稳定性。本研究考察了辅酶Q10微乳在25℃条件下长期放置的稳定性，结果表明该制剂在25℃条件下可稳定放置12个月。

长期、大剂量紫外照射后，人皮肤成纤维细胞和人上皮细胞中ROS的产生速度超过其被清除的速度，损伤的抗氧化防御体系会导致更多ROS的产生。大量损伤诱导的ROS可作为第二信使，刺激基质金属蛋白酶基因转录，促进MMP-1的生成。MMP-1通过水解、破坏及重组细胞外基质，引起皮肤结缔组织结构重建，导致了光老化皮肤特有的粗深皱纹生成[22]。体外活性实验结果表明，模型组经UV辐照后，皮肤成纤维细胞和表皮细胞的ROS、MMP-1水平明显增高，表明UV照射可以造成培养皮肤成纤维细胞的损伤。各剂量辅酶Q10微乳可降低UVA、UVB照射后的皮肤成纤维细胞、表皮细胞中的ROS、MMP-1水平，中高剂量（5、10 μmol/L）效果较好。随着年龄增长，皮肤细胞中的Q10含量会明显降低[23]，因此外源性补充辅酶Q10是一种有效对抗皮肤光老化的方法，辅酶Q10微乳可能对紫外辐照后的光老化具有明显的修复作用。本研究制得的辅酶Q10微乳的透皮吸收能力仍需进一步研究。

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